Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O
Summary
Nile vermelho coloração do fixo Caenorhabditis elegans é um método para a medição quantitativa de depósitos de lipídios neutros, enquanto o óleo vermelho O coloração facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre tecidos.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um organismo modelo excepcional em que para estudar o metabolismo lipídico e homeostase de energia. Muitos dos seus genes de lipídios são conservados em seres humanos e estão associados com a síndrome metabólica ou outras doenças. Exame do acúmulo de lipídios neste organismo pode ser realizada por corantes fixador ou métodos livre de rótulo. Manchas de fixador como Nilo vermelho e O vermelho de óleo são maneiras de baixo custo, confiáveis para medir quantitativamente os níveis de lipídios e observar qualitativamente distribuição de lipídios através de tecidos, respectivamente. Além disso, estas manchas permitem para elevado-throughput screening de vários genes do metabolismo de lipídios e caminhos. Além disso, sua natureza hidrofóbica facilita a solubilidade lipídica, reduz a interação com tecidos circundantes e impede que a dissociação em solvente. Embora esses métodos são eficazes em examinar o teor lipídico geral, eles não fornecem informações detalhadas sobre a composição química e diversidade dos depósitos de lipídios. Para estes fins, livre de rótulo métodos tais como a microscopia de GC-MS e carros estão melhores adequado, os seus custos, não obstante.
Introduction
Lipídios são essenciais para a vida. Eles são componentes integrais das membranas, atuam como mensageiros secundários e Transdutores de sinal e têm funções cruciais no armazenamento de energia. Quando o metabolismo lipídico é prejudicado, leva a doenças como obesidade e diabetes tipo II, que estão pressionando as preocupações de saúde pública9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo modelo excelente em que para estudar o metabolismo lipídico, porque tem um ciclo de vida relativamente curto, um corpo transparente, uma linhagem de células conhecidas e um genoma completamente sequenciado. Principalmente uma hermafrodita, o c. elegans permite que os pesquisadores levantar um grande número de animais isogénicas Resumindo períodos de tempo para realizar elevado-throughput avanço genéticos telas para estudar uma grande variedade de de genes e vias metabólicas4. Esta abordagem revelou-se um elevado grau de conservação em 273 c. elegans genes de metabolismo de lipídios entre seres humanos, ratos, ratos e drosófila. Além disso, mais de 300 genes de lipídios em c. elegans tem orthologues humano que estão associados com doenças não relacionadas com síndrome metabólica11. Tradicionalmente, exame de armazenamento de lipídios em c. elegans principalmente dependeu de tingir-etiquetados ensaios, que fornecem informação robusta sobre o acúmulo de lipídios. Menos comum é uma descrição de onde localizar lipídios e medidas diferenças na abundância de lipídios através de tecidos. No entanto, o trabalho recente revelou que a distribuição de lipídios pode ser tão importante como o acúmulo de lipídios6.
Ultimamente, estudos começaram a integrar métodos como alto rendimento líquido cromatografia / espectrometria de massa (HPLC-MS), cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS), e coerente anti-stokes microscopia de Raman espalhamento (carros) para o endereço a deficiências de mancha-abordagens analisando diretamente o conteúdo de lipídios extratos e frações lipídica específica depósitos lipídicos, respectivamente de10,11. Além disso, a microscopia de carros revelou que vermelho Nilo pode servir apenas como um proxy para o acúmulo de gordura quando usado como um corante fixador, para seu uso como uma mancha vital leva para fora do alvo coloração de organelas autofluorescente10. No entanto, os conhecimentos técnicos necessários e os custos associados a estes cromatografia e métodos de microscopia tornam a sua utilização insustentável para muitas perguntas de pesquisa. Neste artigo, discutimos um método conveniente e confiável para se fixam e manchar os depósitos de lipídios neutros em c. elegans usando Nilo vermelho e O vermelho para distinguir a abundância de lipídios em animais inteiros e em tecidos específicos de óleo.
Nilo vermelho, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, é um corante benzophenoxazone que prontamente se dissolve em diversos solventes orgânicos, mas principalmente é insolúvel em água. É um excelente lisocromo corante usado para manchar lípidos neutros como triglicérides ou ésteres de colesterol porque ele apresenta uma cor forte, solubiliza bem em lipídios, tem interação insignificante com tecidos circundantes e é menos solúveis no solvente do que no lipídios. Tem uma excitação e emissão maxima de 450-500 e 520 nm, respectivamente1. Quando Nilo manchados de vermelho c. elegans é visto por fluorescência verde, corpos lipídico discreta podem ser observados em todo o intestino e outros tecidos ou em aglomerados ou uniformemente dispersos, dependendo do genótipo do animal ou tratamento experimental 7.
O óleo vermelho é um lisocromo, corante lipossolúvel usado para manchar os triglicerídeos e lipoproteínas. Chama-se um corante azoico porque sua estrutura química contém dois grupos azo ligados a três anéis aromáticos. É difícil ionizar, que torna altamente solúvel em lipídios. Sua mancha cor é vermelha e sua absorção de luz máxima é 518 nm 3. C. elegans manchado com óleo vermelho O mostrar gotículas lipídicas vermelho destacam-se contra o corpo do animal transparente, que facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre diferentes tecidos6.
Protocol
Representative Results
Discussion
O aumento da obesidade e doenças metabólicas tarifas faz c. elegans , um modelo adequado para estudar os mecanismos que regulam a acumulação de gordura nas células e tecidos. Recentes sugerem que as mudanças nos níveis de lipídios são correlacionadas com processos celulares que variam de8, a ativação de receptores hormonais2, a saída reprodutivo5a sinalização de insulina. Comparado com rótulo livre microscopia e métodos de cr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi feito possível pela subvenção NIH: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
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