التحديد الكمي لوفرة الدهن وتقييم توزيع الدهن في ايليجانس كاينورهابديتيس "الأحمر النيل" و "النفط تلطيخ س الأحمر"
Summary
النيل الأحمر تلطيخ من الثابتة ايليجانس كاينورهابديتيس طريقة لقياس كمية الرواسب الدهنية محايدة، بينما النفط الأحمر يا تلطيخ يسهل تقييم نوعي لتوزيع الدهون بين الأنسجة.
Abstract
ايليجانس كاينورهابديتيس كائن نموذج استثنائي لدراسة الأيض الدهون والتوازن الطاقة فيه. العديد من الجينات الدهن يتم المحافظة عليها في البشر والمرتبطة بالمتلازمة الأيضية أو غيره من الأمراض. يمكن أن تنفذ دراسة تراكم الدهن في هذا الحي بالأصباغ مثبت أو أساليب خالية من التسمية. البقع مثبت مثل النيل الأحمر والنفط س الحمراء طرق غير مكلفة، ويمكن الاعتماد عليها لقياس مستويات الدهون كمياً ونوعيا مراقبة التوزيع الدهن عبر الأنسجة، على التوالي. وعلاوة على ذلك، تتيح هذه البقع الفرز الفائق من جينات الأيض الدهون ومسارات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، طابعها مسعور يسهل الذوبان في الدهون ويقلل من التفاعل مع المحيط بالانسجة، ويمنع التفكك في المذيب. وعلى الرغم من هذه الأساليب الفعالة في دراسة محتوى الدهون عامة، أنها لا توفر معلومات مفصلة عن التركيب الكيميائي والتنوع من رواسب الدهون. لهذه الأغراض، خالية من تسمية أساليب مثل الفحص المجهري GC-MS والسيارات أفضل ملاءمة، تكاليفها على الرغم من.
Introduction
الدهون ضرورية للحياة. فعناصر لا تتجزأ من الأغشية والعمل كرسل الثانوية وإشارة محولات الطاقة ولها وظائف حيوية في تخزين الطاقة. عند دهن الأيض dysregulated فإنه يؤدي إلى أمراض مثل السمنة ومرض السكري من النوع الثاني، الذي يتم الضغط على شواغل الصحة العامة9. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن حي نموذجا ممتازا لدراسة الأيض الدهني لأنها لها دورة حياة قصيرة نسبيا وهيئة شفافة ونسب خلية معروفة وجينوم تسلسل الكامل. يسمح أساسا خنثي، C. ايليجانس الباحثين لرفع عدد كبير من الحيوانات اسوي باختصار فترات من الوقت للقيام الفائق شاشات الجينية إلى الأمام لدراسة طائفة واسعة من الجينات والمسارات الأيضية4. وقد كشف هذا النهج درجة عالية من الحفظ في C. ايليجانس 273 دهن الأيض الجينات بين البشر والفئران والجرذان والمورفولوجية. وعلاوة على ذلك، بما يزيد على 300 الدهن الجينات في C. ايليجانس أورثولوجويس البشرية المرتبطة بالأمراض التي لا علاقة لها بالمتلازمة الأيضية11. تقليديا، دراسة تخزين الدهون في C. ايليجانس معظمها يعتمد على فحوصات المسمى صبغ، التي توفر معلومات قوية حول تراكم الدهن. أقل شيوعاً وصف فيها تعريب الدهون وقياس الاختلافات في وفرة الدهن عبر الأنسجة. ومع ذلك، كشفت الأعمال الأخيرة أن توزيع الدهن يمكن أن تكون هامة مثل تراكم الدهن6.
في الآونة الأخيرة، وقد بدأت دراسات إدماج أساليب مثل عالية الأداء السائل اللوني-قياس الطيف الكتلي ([هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد)، الفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)، ومتماسكة المضادة-ستوكس رامان مجهرية نثر (السيارات) للتصدي أوجه قصور نهج المستندة إلى وصمة عار بتحليل محتويات مقتطفات الدهن والدهن محددة الكسور ورواسب الدهن، على التوالي10،11مباشرة. وعلاوة على ذلك، كشفت مجهرية السيارات أن النيل الأحمر يمكن أن تصلح كوكيل لتراكم الدهون عند استخدامها كصبغة مثبت، لاستعماله وصمة عار حيوية يؤدي إلى تلطيخ خارج الهدف للسيارات-فلوري العضيات10فقط. بيد أن الخبرة الفنية المطلوبة والتكاليف المرتبطة بهذه اللوني وأساليب الفحص المجهري يجعل استخدامها لا يمكن الدفاع عنها للعديد من الأسئلة البحثية. في هذه المقالة، نحن نناقش أسلوب مناسب وموثوق بها يحملق ووصمة عار رواسب الدهون محايدة في C. ايليجانس استخدام النيل الأحمر والنفط س الأحمر التمييز بين وفرة الدهون في الحيوانات كلها وفي أنسجة محددة.
النيل الأحمر، 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one، هو صبغة بينزوفينوكسازوني سهولة يذوب في المذيبات العضوية المختلفة، بل هو في الغالب غير قابلة للذوبان في الماء. فهو صبغ ليسوتشرومي ممتازة تستخدم لوصمة عار الدهون محايدة مثل الشحوم أو استرات الكوليسترول نظراً لأنه يتميز بلون قوي، سولوبيليزيس كذلك في الدهون، أصبحت لا تذكر من التفاعل مع الأنسجة المحيطة، وهو أقل قابل للذوبان في المذيبات مما في الدهون. فقد ماكسيما الإثارة والانبعاثات من 450-500 و 520 نانومتر، على التوالي1. عندما يتم عرض النيل C. ايليجانس ملطخة بالأحمر الفلورية الخضراء، هيئات منفصلة في الدهون يمكن مراعاتها في جميع أنحاء الأمعاء والأنسجة الأخرى أما في مجموعات أو موزعة بالتساوي، تبعاً للنمط الوراثي للحيوان أو العلاج التجريبي 7.
O النفط الأحمر هو ليسوتشرومي، وتذوب صبغة تستخدم لوصمة عار الشحوم والبروتينات الدهنية. ويسمى صبغة الآزو لبنيتها الكيميائية تحتوي على مجموعتين الآزو يعلق على الحلقات العطرية الثلاثة. من الصعب أن تتأين، مما يجعلها عالية قابلة للذوبان في الدهون. أحمر لونه وصمة عار وامتصاص الضوء في أقصى 518 شمال البحر الأبيض المتوسط 3. C. ايليجانس ملطخة بالزيت يا الحمراء تظهر قطرات الدهن الحمراء التي تبرز ضد جسم الحيوان شفافة، مما يسهل تقييم نوعي لتوزيع الدهون بين أنسجة مختلفة6.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجعل ارتفاع معدلات الأمراض الأيضية والسمنة C. ايليجانس نموذج مناسب دراسة الآليات التي تنظم تراكم الدهون في الخلايا والأنسجة. تشير الدلائل الأخيرة إلى أن التغيرات في مستويات الدهون ترتبط بالعمليات الخلوية التي تتراوح بين الأنسولين مما يشير إلى8، تنشيط هرمون مستقبلات<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل ممكناً بمنح المعاهد الوطنية للصحة: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. . Conn’s biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
