Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans
Summary
Nil rouge coloration fixe Caenorhabditis elegans est une méthode pour la mesure quantitative des dépôts de lipides neutres, alors que l’huile rouge O coloration facilite l’évaluation qualitative de la répartition des lipides entre les tissus.
Abstract
Caenorhabditis elegans est un organisme modèle exceptionnel permettant d’étudier le métabolisme des lipides et l’homéostasie énergétique. Beaucoup de ses gènes de lipides sont conservés chez les humains et sont associées à un syndrome métabolique ou d’autres maladies. Examen de l’accumulation de lipides dans cet organisme peut être effectué par colorants fixateur ou méthodes exempte d’étiquette. Taches de fixateur comme Nil rouge et huile O rouge sont des moyens peu coûteux et fiables de mesurer quantitativement le taux de lipides et de qualitativement observer distribution des lipides dans les tissus, respectivement. De plus, ces taches permettent de criblage à haut débit des diverses voies et les gènes du métabolisme lipidique. En outre, leur caractère hydrophobe facilite la liposolubilité, réduit l’interaction avec les tissus environnants et empêche la dissociation dans le solvant. Bien que ces méthodes sont efficaces pour examiner le contenu en lipides générales, ils ne fournissent pas d’informations détaillées sur la composition chimique et la diversité des dépôts lipidiques. Pour ces fins, exempte d’étiquette des méthodes telles que la microscopie GC-MS et les voitures sont mieux adapté, leurs coûts par dérogation.
Introduction
Les lipides sont essentiels à la vie. Ils font partie intégrante des membranes, agissent comme des messagers secondaires et transducteurs de signal et ont des fonctions cruciales dans le stockage de l’énergie. Lorsque le métabolisme des lipides est dysrégulation, elle conduit à des maladies comme l’obésité et le diabète de type II, qui sont en appuyant sur les préoccupations de santé publique9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme excellent modèle pour l’étude du métabolisme lipidique, parce qu’il a un cycle de vie relativement court, un corps transparent, une lignée de cellules connues et un génome entièrement séquencé. Principalement un hermaphrodite, c. elegans permet aux chercheurs de soulever un grand nombre d’animaux isogéniques bref une période à haut débit effectuer avancer écrans génétiques pour étudier un large éventail de gènes et les voies métaboliques4. Cette approche a révélé un haut degré de conservation en 273 gènes du métabolisme lipidique de c. elegans parmi les humains, les souris, les rats et les drosophiles. En outre, plus de 300 gènes de lipides chez c. elegans ont des orthologues humains qui sont associés à des maladies non liées au syndrome métabolique,11. Traditionnellement, examen de stockage lipidique chez c. elegans a principalement invoqué essais marqués au colorant, qui fournissent des renseignements solides sur l’accumulation de lipides. Moins fréquent est une description de localiser où les lipides et les différences mesurées en abondance de lipides dans les tissus. Cependant, des travaux récents ont révélé que distribution des lipides peut être aussi importante que l’accumulation de lipides6.
Dernièrement, des études ont commencé à intégrer des méthodes telles que haute performance liquid chromatography-spectrométrie de masse (HPLC-MS), chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), et cohérente anti-stokes la microscopie Raman diffusion (voitures) à l’adresse du lacunes des approches axées sur la tache en analysant directement le contenu des extraits lipidiques, fractions lipidiques spécifiques et les dépôts de lipides, respectivement10,11. En outre, la microscopie de voitures a révélé que rouge Nil seulement peut servir de proxy pour une accumulation de graisse lorsqu’il est utilisé comme teinture fixateur, pour son utilisation comme un colorant vital conduit à hors-cible la coloration des organites auto-fluorescent10. Toutefois, les compétences techniques requises et les coûts associés à ces chromatographie et méthodes de microscopie font leur utilisation intenable pour plusieurs questions de recherche. Dans cet article, nous discutons une méthode pratique et fiable pour fixer et tacher les dépôts de lipides neutres à l’aide du Nil rouge de c. elegans et huile rouge O pour distinguer l’abondance de lipides chez l’animal entier et dans des tissus spécifiques.
Rouge de Nil, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, est un colorant benzophenoxazone facilement, se dissout dans les solvants organiques divers, mais est le plus souvent insoluble dans l’eau. C’est un excellent lysochrome colorant utilisé pour colorer les lipides neutres tels les triglycérides ou des esters de cholestérol parce qu’il dispose d’une couleur forte, solubilise bien dans les lipides, a interaction négligeable avec les tissus environnants et est moins solubles dans le solvant que dans lipides. Il a un maximum d’excitation et d’émission de 450-500 et 520 nm, respectivement1. Nil colorées au rouge c. elegans est vu pour la fluorescence verte, corps lipidiques discrètes peuvent être observés tout au long de l’intestin et d’autres tissus soit en grappes ou réparties, selon le génotype de l’animal ou de traitement expérimental 7.
L’huile rouge O est un lysochrome, un colorant soluble dans la graisse utilisée pour colorer les triglycérides et lipoprotéines. On l’appelle un colorant azoïque parce que sa structure chimique contient deux groupes azoïques attachés à trois noyaux aromatiques. Il est difficile de s’ioniser, qui le rend très soluble dans les lipides. Sa tache de couleur est rouge et son absorption maximale de la lumière est 518 nm 3. C. elegans colorées avec de l’huile rouge O montrent des gouttelettes de lipides rouge qui se démarquent contre corps transparent de l’animal, ce qui facilite l’évaluation qualitative de la distribution des lipides chez les différents tissus6.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’augmentation de l’obésité et les taux de maladies métaboliques rend c. elegans , un modèle approprié pour étudier les mécanismes qui régulent l’accumulation de graisses dans les cellules et les tissus. Des preuves récentes suggèrent que les changements dans les taux de lipides sont corrélés avec des processus cellulaires, allant de l’insuline signalisation8, l’activation des récepteurs hormone2, à la capacité reproductrice<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible par l’octroi de NIH : R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
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