尼罗红与油红 O 染色法测定秀丽线虫的脂质丰度及脂质分布评价
Summary
固定秀丽线虫的尼罗河红色染色是一种定量测量中性脂质矿床的方法, 而油红色 O 染色有助于定性评价组织间脂质的分布。
Abstract
秀丽线虫是一种特殊的模型有机体, 用于研究脂质代谢和能量稳态。许多脂质基因在人类中被保存, 并与代谢综合征或其他疾病有关。通过固定染料或无标签的方法对机体脂质积累进行检查。像尼罗河红色和油红色 O 的固定污渍是廉价的, 可靠的方法来定量测量脂质水平, 并定性地观察各组织的脂质分布。此外, 这些污渍允许高通量筛选各种脂代谢基因和途径。此外, 其疏水性的性质有利于脂溶性, 减少与周围组织的相互作用, 并防止离解进入溶剂。虽然这些方法是有效的检查一般脂质含量, 他们没有提供详细信息的化学成分和多样性的脂质矿床。为了这些目的, 无标签的方法, 如 GC-MS 和汽车显微术更适合, 他们的成本尽管。
Introduction
血脂对生命至关重要。它们是膜的组成部分, 作为辅助信使和信号传感器, 在储能中具有重要的作用。当脂质代谢是失调, 它导致疾病, 如肥胖和 II 型糖尿病, 这是紧迫的公共卫生问题9。秀丽线虫(线虫) 是研究脂质代谢的优秀模型有机体, 因为它具有相对较短的生命周期、透明的身体、已知的细胞谱系和完全有序的基因组。主要是雌雄同体,线虫允许研究人员在短时间内培养大量的等基因系动物, 以进行高通量的前基因筛, 研究多种代谢基因和通路4。这种方法在273种线虫脂代谢基因中发现了高度的保护, 如人类、老鼠、老鼠和果蝇。此外, 在线虫中有300多种脂质基因有与代谢综合征相关的疾病的人类 orthologues11。传统上, 对线虫中脂质贮存的检查大多依赖于染料标记的化验, 这为脂质积累提供了可靠的信息。不太常见的是关于脂质的本地化和测量不同组织脂质丰度差异的描述。然而, 最近的工作表明, 脂质分布可以和脂质积累一样重要6。
最近, 研究已经开始整合的方法, 如高效液相色谱-质谱 (HPLC), 气相色谱-质谱 (GC), 和相干反斯托克斯拉曼散射 (汽车) 显微镜, 以解决通过直接分析脂质提取物、特定脂质组分和脂质沉积物的含量, 分别为10、11, 以染色为基础的方法的缺点。此外, 汽车显微学已经表明, 尼罗河红色只能作为一个代理的脂肪积累时, 用作固定染料, 因为它作为一个重要的污点, 导致非目标染色的自动荧光器10。然而, 与这些色谱和显微学方法相关的必要技术专长和成本使得它们在许多研究问题上的使用站不住脚。在本文中, 我们讨论了一种方便可靠的方法来锁定和染色中性脂质矿床的C. 线虫使用尼罗河红和油红色 O 区分脂质丰度在整个动物和特定组织。
尼罗河红, 9-二氨基-5 h 苯并 [α] phenoxazine-5-一, 是一种 benzophenoxazone 染料, 容易溶解在各种有机溶剂, 但大多不溶于水。它是一种很好的 lysochrome 染料, 用来染色中性脂类, 如甘油三酯或胆固醇酯, 因为它具有强烈的颜色, solubilizes 良好的脂质, 与周围组织的相互作用微不足道, 而且不溶于溶剂比血脂.它的激发和发射最大值为450-500 和 520 nm, 分别为1。当对尼罗河红色染色的线虫进行绿色荧光观察时, 可以在整个肠道和其他组织中以团簇或均匀分散的方法观测离散脂质体, 这取决于动物的基因型或实验性治疗7。
油红色 O 是一种 lysochrome 脂溶性染料, 用于染色甘油三酯和脂蛋白。它被称为偶氮染料, 因为它的化学结构含有两个偶氮基团附着在三芳香环上。这是很难电离, 使其高度溶于脂质。其着色色为红色, 其光吸收最大值为 518 nm 3。C. 线虫染色的油红色 O 显示红色脂滴, 突出反对动物的透明身体, 这有助于定性评估不同组织之间的脂质分布6。
Protocol
Representative Results
Discussion
肥胖和代谢性疾病发病率的上升使线虫成为研究细胞和组织中脂肪积累机制的合适模型。最近的证据表明, 脂质水平的变化与细胞过程相关, 从胰岛素信号8, 激活激素受体2, 到生殖输出5。与无标签显微镜和色谱方法相比, 尼罗河红和油红色 O 是相对便宜的染料, 用于染色蠕虫的中性脂一贯和重现性 10, 12, 13.<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是有可能的 NIH 补助金: R01GM109028 (爱护动物协会)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
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