Kvantifisering av Lipid overflod og evaluering av Lipid distribusjon i Caenorhabditis elegans av Nilen rød og olje Red O flekker
Summary
Nilen røde flekker av fast Caenorhabditis elegans er en metode for kvantitativ måling av nøytrale lipid innskudd, mens olje røde O flekker forenkler kvalitativ vurdering av lipid fordeling mellom vev.
Abstract
Caenorhabditis elegans er en utmerket modell organisme i å studere lipid metabolisme og energi homeostase. Mange av sine lipid gener er bevart i mennesker og er tilknyttet Metabolsk syndrom eller andre sykdommer. Undersøkelse av lipid akkumulering i denne organismen kan utføres av etappe, den stabiliserende fargestoffer eller etikett-fri metoder. Etappe, den stabiliserende flekker som Nile rød og olje røde O er rimelige, pålitelige måter å måle kvantitativt lipid nivåer og kvalitativt observere lipid distribusjon over vev, henholdsvis. Videre gir disse flekker høy gjennomstrømming screening av ulike lipid metabolisme gener og veier. I tillegg sine hydrofobe natur forenkler lipid løselighet, reduserer interaksjon med omkringliggende vev, og hindrer dissosiasjon i løsemiddelet. Disse metodene er effektiv på å undersøke de generelle lipid innhold, gir de ikke detaljert informasjon om kjemisk sammensetning og mangfoldet av lipid innskudd. For disse formål, etikett-fri metoder som GC-MS og biler mikroskopi er bedre egnet, kostnadene til tross.
Introduction
Lipider er avgjørende for liv. De er integrert komponenter i membraner, fungere som sekundær budbringere og signalisere transduktorer, og har viktige funksjoner i energilagring. Når lipid metabolisme er dysregulated, fører det til sykdommer som fedme og type II diabetes, som trykker offentlig helse bekymringer9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en utmerket modell organisme i å studere lipid metabolisme fordi den har en relativt kort livssyklus, en transparent kropp, en kjent celle avstamning og et fullt sekvensert genom. Først og fremst en Hermafroditt, C. elegans tillater forskere å heve store mengder isogenic dyr i korte perioder carryout høy gjennomstrømming frem genetisk skjermene å studere en rekke metabolske gener og veier4. Denne tilnærmingen har avsløre en høy grad av bevaring i 273 C. elegans lipid metabolisme gener blant mennesker, mus, rotter og drosophila. Videre har over 300 lipid gener i C. elegans menneskelige orthologues som er knyttet til sykdommer relatert til Metabolsk syndrom11. Tradisjonelt er undersøkelse av lipid lagring i C. elegans hovedsakelig basert på fargestoff-merket analyser, som gir robust opplysninger lipid akkumulering. En beskrivelse av hvor lipider lokalisere og målt forskjeller i lipid overflod er over vev. Men har nyere arbeid avdekket at lipid distribusjon kan være like viktig som lipid akkumulering6.
I det siste, studier har begynt å integrere metoder som høy ytelse flytende kromatografi-massespektrometri (såkalt HPLC-MS), gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS), og sammenhengende anti-stokes Raman spredning (biler) mikroskopi adresse i mangler av flekken tilnærminger av direkte analysere innholdet av lipid ekstrakter, bestemte lipid fraksjoner og lipid innskudd, henholdsvis10,11. Videre har biler mikroskopi avdekket at Nilen røde kan bare tjene som en proxy for fett ansamling når den brukes som en etappe, den stabiliserende fargestoff, for sin bruk som en viktig flekken fører til off-målet farging av auto-fluorescerende organeller10. Men de nødvendige tekniske kompetanse og kostnadene forbundet med disse kromatografi og mikroskopi metoder gjør bruken uholdbar for mange forskning spørsmål. I denne artikkelen diskutere vi en praktisk og pålitelig metode for å fixate og flekken nøytral lipid innskudd i C. elegans bruker Nilen rød og olje røde O for å skille lipid overflod i hele dyr og bestemt vev.
Nilen rød, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, er en benzophenoxazone farge som lett oppløses i ulike organiske løsemidler, men er mest uløselig i vann. Det er en utmerket lysochrome fargestoff brukt stain nøytral lipider som triglyserider eller kolesterol estere fordi den har en sterk farge, solubilizes i lipider, har ubetydelig samhandling med omkringliggende vev, og mindre løselig i løsemiddelet enn i lipider. Den har en eksitasjon og utslipp maxima 450-500 og 520 nm, henholdsvis1. Nilen rød-farget C. elegans er sett til grønne fluorescens, kan diskret lipid organer observeres under tarmen og andre vev enten i grupper eller jevnt spredt, avhengig av dyrets genotype eller eksperimentell behandling 7.
Olje røde O er en lysochrome, fettløselige fargestoff brukes stain triglyserider og lipoproteiner. Det kalles en azo fargestoff fordi den kjemiske strukturen inneholder to azo grupper knyttet til tre aromatiske ringer. Det er vanskelig å ionisere, noe som gjør det svært løselig i lipider. Dens lys absorpsjon maksimal er 518 nm 3flekken fargen er rød. C. elegans farget med olje røde O Vis røde lipid dråper som skiller seg ut mot dyr transparent kropp, som muliggjør kvalitativ vurdering av lipid fordeling mellom forskjellige vev6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Økningen i overvekt og metabolsk sykdom priser gjør C. elegans en passende modell å studere mekanismer som regulerer fett ansamling i celler og vev. Nyere bevis antyder at endringene i lipid nivåer er korrelert med cellulære prosesser fra insulin signalering8, aktivering av hormon reseptorer2, reproduktive utgang5. Rød O sammenlignet etikett-fri mikroskopi og kromatografi metoder, Nilen rød og olje og er relativt billig fargestoffer b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble gjort mulig ved NIH stipendet: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. . Conn’s biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
