Kvantificering af Lipid overflod og evaluering af Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans af Nilen rød og olie røde O farvning
Summary
Nile rød farvning af fast Caenorhabditis elegans er en metode til kvantitativ måling af neutrale lipid indskud, mens olie røde O farvning letter kvalitativ vurdering af lipid fordeling blandt væv.
Abstract
Caenorhabditis elegans er en enestående model organisme i at studere lipid metabolisme og energi homøostase. Mange af dens lipid gener er bevaret hos mennesker og er forbundet med metabolisk syndrom eller andre sygdomme. Undersøgelse af lipid ophobning i denne organisme kan udføres af Fikseringsvæske farvestoffer eller etiket-fri metoder. Fikseringsvæske pletter som Nilen rød og olie røde O er billige og pålidelige måder at måle kvantitativt lipidniveauer og kvalitativt observere lipid distribution på tværs af væv, henholdsvis. Derudover tillader disse pletter high throughput screening af forskellige lipid metabolisme gener og veje. Derudover deres hydrofob karakter letter fedtopløselighed, reducerer interaktion med omgivende væv, og forhindrer dissociation i opløsningsmidlet. Selv om disse metoder er effektive til at undersøge generelle lipid indhold, giver de ikke detaljerede oplysninger om den kemiske sammensætning og mangfoldighed af lipid indskud. Til disse formål, etiket-gratis metoder såsom GC-MS og biler mikroskopi er bedre egnet, deres omkostninger uanset.
Introduction
Lipider er afgørende for liv. De er integrerende dele af membraner, fungere som sekundære budbringere og signal transducere og er livsvigtige funktioner i energilagring. Når lipid metabolisme er dysregulated, fører det til sygdomme som fedme og type II diabetes, som presser offentlige sundhed bekymringer9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en fremragende model organisme i at studere lipid metabolisme, fordi det har en relativt kort levetid, en gennemsigtig krop, en kendt celle afstamning og en fuldt sekventeret genom. Primært en hermafrodit, C. elegans kan forskere at hæve store antal isogene dyr i korte perioder af tid til at foretage høj overførselshastighed fremad genetiske skærme til at studere en bred vifte af metaboliske gener og veje4. Denne tilgang har afsløret en høj grad af bevarelse i 273 C. elegans lipid metabolisme gener blandt mennesker, mus, rotter og drosophila. Derudover har over 300 lipid gener i C. elegans menneskelige orthologues, der er knyttet til sygdomme relateret til Metaboliske syndrom11. Undersøgelse af lipid opbevaring i C. elegans har traditionelt, for det meste påberåbt dye-mærket assays, som giver robust oplysninger om lipid ophobning. Mindre udbredt er en beskrivelse af hvor lipider lokalisere og målte forskelle i lipid overflod på tværs af væv. Seneste arbejde viste imidlertid, at lipid distribution kan være lige så vigtig som lipid ophobning6.
Sidst, studier er begyndt at integrere metoder såsom højtydende liquid chromatography-massespektrometri (HPLC-MS), gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), og sammenhængende anti-stokes Raman spredning (biler) mikroskopi til adresse den mangler af pletten-baserede tilgange ved direkte analysere indholdet af lipid ekstrakter, specifikke lipid fraktioner og lipid indskud, henholdsvis10,11. Derudover har biler mikroskopi afsløret, at Nilen rød kun kan tjene som en proxy for fedtophobning når det bruges som en Fikseringsvæske farvestof, for dets anvendelse som en vital pletten fører til off-target farvning af auto-fluorescerende organeller10. Men den nødvendige tekniske ekspertise og omkostningerne forbundet med disse kromatografi og mikroskopi metoder gøre deres brug uholdbar for mange forskningsspørgsmål. I denne artikel vil diskutere vi en bekvem og pålidelig metode til at fiksere og plette neutral lipid indskud i C. elegans ved hjælp af Nilen rød og olie røde O for at skelne lipid overflod i hele dyr og i bestemte væv.
Nile rød, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, er en benzophenoxazone farvestof, der let opløses i forskellige organiske opløsningsmidler, men er for det meste uopløseligt i vand. Det er en fremragende lysochrome farvestof bruges til at plette neutral lipider som triglycerider eller kolesterol estere fordi det har en stærk farve, solubilizes godt i lipider, har ubetydelig interaktion med omgivende væv, og er mindre opløselige i opløsningsmiddel end i lipider. Det har en excitations- og maxima af 450-500 og 520 nm, henholdsvis1. Når Nile rød-farvede C. elegans ses til grønne fluorescens, kan diskrete lipid organer overholdes i hele tarmen og andre væv enten i klynger eller jævnt spredt, afhængig af dyrets genotype eller eksperimentel behandling 7.
Olie røde O er en lysochrome, fedtopløselige farvestof bruges til at plette triglycerider og lipoproteiner. Det kaldes et azofarvestof, fordi dens kemiske struktur indeholder to azo grupper knyttet til tre aromatiske ringe. Det er vanskeligt at ionisere, som gør det meget opløseligt i lipider. Dens pletten farve er rød og dens maksimale lysabsorption er 518 nm 3. C. elegans farves med olie røde O Vis rød lipid dråber, der skiller sig ud mod dyrets gennemsigtige krop, som letter kvalitativ vurdering af lipid fordelingen mellem forskellige væv6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stigningen i fedme og metaboliske sygdomme priser gør C. elegans en passende model til at studere de mekanismer, der regulerer fedt ophobning i celler og væv. Seneste tyder på, at ændringer i lipidniveauer er korreleret med cellulære processer lige fra insulin signalering8, aktivering af hormonet receptorer2, at formeringsevnen5. I forhold til etiket-fri mikroskopi og kromatografi metoder, Nile rød og olie røde O er relativt billig fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev muliggjort af NIH grant: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. . Conn’s biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
