Kvantifiering av Lipid överflöd och utvärdering av Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans av Nile rött och olja röd O färgning
Summary
Nile röda färgning av fasta Caenorhabditis elegans är en metod för kvantitativ mätning av neutrala lipid insättningar, medan olja röd O färgning underlättar kvalitativ bedömning av lipid fördelning mellan vävnader.
Abstract
Caenorhabditis elegans är en enastående modellorganism där studera lipidmetabolismen och energi homeostas. Många av dess lipid gener bevaras hos människor och är associerade med metabolt syndrom eller andra sjukdomar. Undersökning av lipid ackumulering i denna organism kan utföras av fixativ färgämnen eller etikett-fria metoder. Fixativ fläckar som Nilen röd och olja röd O billig, pålitlig sätt att kvantitativt mäta lipidnivåer och kvalitativt iaktta lipid distribution i vävnader, respektive. Dessutom tillåta dessa fläckar för high-throughput screening av olika lipid metabolism gener och vägar. Dessutom sin hydrofoba natur underlättar lipidlöslighet, minskar samspel med omgivande vävnader och förhindrar dissociation i lösningsmedlet. Även om dessa metoder är effektiva på att undersöka allmänna fettinnehållet, ger de inte detaljerad information om den kemiska sammansättningen och mångfalden av lipid insättningar. För dessa ändamål, etikett-fria metoder såsom GC-MS och bilar mikroskopi är bättre lämpade, sina kostnader utan hinder.
Introduction
Lipider är väsentliga för livet. De är integrerade delar av membran, fungera som sekundära budbärare och signalera givare har avgörande funktioner i energilagring. När lipidmetabolismen dysreglerad, leder det till sjukdomar som fetma och diabetes typ II, som trycka på folkhälsan oro9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en utmärkt modellorganism som att studera lipidmetabolismen eftersom den har relativt kort livslängd, en transparent kropp, en känd cell härstamning och ett fullt sekvenserat genomet. Primärt en hermafrodit, C. elegans tillåter forskare att höja stort antal syngena djur kort tid för att utföra hög genomströmning framåt genetiska skärmar för att studera en rad olika metaboliska gener och vägar4. Denna strategi har visat en hög grad av bevarande i 273 C. elegans lipid metabolism gener bland människor, möss, råttor och drosophila. Över 300 lipid gener i C. elegans har dessutom mänskliga orthologues som är associerade med sjukdomar orelaterade till metabola syndromet11. Granskning av lipid lagring i C. elegans har traditionellt, främst förlitat sig på dye-märkt analyser, som ger robust information om lipid ackumulering. Mindre vanliga är en beskrivning av där lipider lokalisera och uppmätta skillnader i lipid överflöd över vävnader. Senaste arbete har dock visat att lipid fördelning kan vara lika viktigt som lipid ackumulering6.
Nyligen, studier har börjat integrera metoder såsom högpresterande liquid chromatography-masspektrometri (HPLC-MS), gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), och sammanhängande anti-stokes Raman spridning (bilar) mikroskopi till adress den bristerna i fläcken tillvägagångssätt genom att direkt analysera innehållet i lipid extrakt, särskilda lipid bråk och lipid insättningar, respektive10,11. BILAR mikroskopi har dessutom avslöjat att Nilen red endast kan fungera som en proxy för ansamling av fett när den används som ett fixativ färgämne, för dess användning som en vital fläcken leder till off-target färgning av auto-fluorescerande organeller10. Men det krävs teknisk expertis och kostnader i samband med dessa kromatografi och mikroskopi metoder gör deras användning ohållbar för många forskningsfrågor. I den här artikeln diskuterar vi en bekväm och pålitlig metod för att fixera och fläcken neutrala lipid insättningar i C. elegans med Nile röd och olja röd O för att skilja lipid överflöd i hela djur och i specifika vävnader.
Nile röd, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, är en benzophenoxazone färgämne som lätt löser sig i olika organiska lösningsmedel, men mestadels är olöslig i vatten. Det är en utmärkt lysochrome färgämne brukade färga neutrala lipider som triglycerider eller kolesterol estrar eftersom det finns en stark färg, solubilizes väl i lipider, har försumbar interaktion med omgivande vävnader och är mindre lösligt i lösningsmedlet än i lipider. Den har en excitation och utsläpp maxima 450-500 och 520 nm, respektive1. När Nilen röd-färgade C. elegans är ses för grön fluorescens, kan diskreta lipid organ observeras i hela tarmen och andra vävnader antingen i kluster eller jämnt spridda, beroende på djurets genotyp eller experimentell behandling 7.
Olja röd O är en lysochrome, fettlösligt färgämne som används för att färga triglycerider och lipoproteiner. Det kallas en azofärg eftersom dess kemiska struktur innehåller två azogrupper bifogas tre aromatiska ringar. Det är svårt att jonisera, som återger det lättlösligt i lipider. Dess fläck färg är röd och dess ljus absorptionsmaximum är 518 nm 3. C. elegans målat med olja röd O Visa röda lipid droppar som sticker ut mot djurets transparent kropp, vilket underlättar kvalitativ bedömning av lipid fördelning mellan olika vävnader6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ökningen av fetma och metabola sjukdomar priser gör C. elegans en lämplig modell för att studera de mekanismer som reglerar fettansamling i celler och vävnader. Nyligen tyder på att förändringar i lipidnivåer är korrelerade med cellulära processer alltifrån insulin signalering8, aktivering av hormon receptorer2, att reproduktionskapaciteten5. Röd O jämfört med etikett-fri mikroskopi och kromatografiska metoder, Nile röd och o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har gjorts möjlig genom NIH bidraget: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. . Conn’s biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
