Intraportal Transplantation af pancreas Holme i musen Model
Summary
Pancreas islet transplantation er en måde at opnå normoglycemia i type 1 diabetes. Denne artikel fokuserer på transplantation teknik gennem ruten intraportal at opretholde normale blodsukkerniveauer i diabetisk mus.
Abstract
Pancreas islet transplantation at reducere hyperglykæmi er meget vellykket i gnavere med kemisk induceret diabetes. Den mest almindelige transplantation site i eksperimentel islet transplantation er nyre kapsel. Dog som mindre viden om samspillet mellem pancreas Holme og blodkomponenter, giver det også mening at bruge portalen vene tilgang i eksperimentel islet transplantation.
Denne protokol viser en intraportal Holmen transplantation teknik i NMRI nøgen mus. Streptozotocin (180 mg/kg) sprøjtes intraperitoneal for at fremkalde hyperglykæmi i modtagerens mus. De betragtes som diabetiker på en ikke-fastende blodsukker niveau større end 20 mmol/L. En dag før transplantation, er mus i bugspytkirtlen Holme isoleret fra donor bugspytkirtlen af collagenase fordøjelsen; et minimum af 350 småøer er udnyttet pr. diabetisk modtager. Afhængig af holmen isolation udbytte, er to eller flere donor mus udnyttet pr. modtager. Efter overnatning kultur ved 37 ° C administreres Holme ind i modtagerens leveren via portalen vene. Efter kirurgi, mus er beskyttet i rød Makrolon huse og observeret indtil er vågen. Denne protokol fastholder glykæmisk kontrol for 120 dage i syngeneic mus og 15 dage i allogen mus.
Introduction
Holmen transplantation er en lovende metode til behandling af type 1 diabetes mellitus1. Det første forsøg på at overføre en får i bugspytkirtlen Fragmentets ind en diabetisk patient blev udført af Watson Williams i 1893. Dog et stort gennembrud i klinisk islet transplantation blev opnået med Edmonton-protokollen, og derefter en række nationale programmer blev udviklet2. I fortiden, flere steder, såsom knoglemarv, omental pose, intramuskulær region, gastrisk slimhinden, milt og nyre kapsel, blev undersøgt i prækliniske modeller, men den portalen venøse system anses som en af de hensigtsmæssige og effektive hjemmeside for klinisk programmer3,4,5,6.
Eksogene administration af insulin kan erstattes af holmen infusion ind i vena. Dette anses en foretrukne websted, fordi ilttilførslen er sammenlignelig med i native bugspytkirtlen på grund af placeringen nedstrøms i sammenløbet af portalen arterie og vene. Derudover er der et stort areal, så den tre-dimensionelle struktur af holmene kan bevares, og vascularization kunne lettes5. I en modtagende diabetisk mus, 2.000 menneskelige eller svin islet ækvivalenter eller 350 mus er Holme passende at vende hyperglykæmisk stat7,8. Euglycemic niveauer blev rapporteret for 15 dage i den modtagende musemodel, xenogene Holme og modellens allogene mus til mus, og mere end 120 dage i syngeneic mus til mus transplantation.
Faktorer, der er relevante for effekten af holmen transplantation via portalen vene er passende anæstesi, punktering og hæmostase9. Anæstesi kan fremkaldes ved indånding (5% isofluran) eller injektion (ketamin, xylazin eller pentobarbital), og stofferne kombineres ofte. Kontrol af dybden og tidspunkt for anæstesi, bør være opmærksom tilstand af musen, som farven på slimhinderne, øjenlåg, cornea refleks, respirationsfrekvens og kropstemperatur. Det er vigtigt at sikre, at dyret ikke kæmper, og at det overlever handlingen. Temperaturen kan vedligeholdes af forskellige varme enheder, såsom varmepuder, røde pærer, etc. A varmt termisk plade er blevet brugt til at opretholde en temperatur på 25-30 ° C mellem mus og driften tabellen, som forhindrer forekomsten af hypotermi. Doser af anæstetika er vigtig, da alle af dem er metaboliseres i leveren og portallymfeknuderne funktion kan forbigående uordnede ved infusion af holmen suspension. Det ideelle punktering punkt for portalen vene er position mellem den første og anden biflod vene.
Antallet af Holme og den tilsigtede Injektionsvolumen også påvirke resultatet af transplantation, som en overdreven volumen kan øge shear stress. En 0,2 mL volumen er hensigtsmæssigt for Holmen transplantation ind i vena. De puncturing sår (26-gauge kanyle) inducerer blødning fra portalen vene, som skal stoppes i en rettidig og effektiv måde. Steril gaze eller en finger kan anvendes med minimal Tryk på stedet, hvor punktering i ca 6 min at stoppe blødningen. Taget sammen, portal islet injektion er effektive og giver forordning over blodsukkerniveauet i kemisk inducerede diabetisk musemodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse, er den intraportal rute af holmen transplantation udforsket. Denne protokol er yderst effektiv til at lindre diabetisk stress og en dybdegående mulighed for at udforske islet transplantation undersøgelser. Denne protokol bekræfter, at omkring 350 murine Holme er i stand til at vende den hyperglykæmisk stat. Desuden, ingen af musene døde under proceduren, og glykæmisk kontrol blev opnået i alle modtagere. Kroppens vægt og blod glucose niveauer blev regelmæssigt registreret afspejler kompete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende Gundula Hertl for hendes støtte.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
