Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo
Summary
Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.
Abstract
Trapianto di isole pancreatiche per ridurre l’iperglicemia è altamente-riuscito nei roditori con diabete indotto chimicamente. Il sito più comune di trapianto trapianto di insule sperimentale è la capsula del rene. Tuttavia, come di meno è conosciuto circa l’interazione degli isolotti pancreatici con costituenti del sangue, ha anche senso di utilizzare l’approccio della vena portale nel trapianto di insule pancreatiche sperimentale.
Questo protocollo dimostra una tecnica di trapianto dell’isolotto intraportal in topi nudi NMRI. Streptozotocin (180 mg/kg) è iniettato intraperitonealmente per indurre l’iperglicemia nei topi di destinatario. Sono considerati come diabetico a un livello di glucosio nel sangue non a digiuno superiore a 20 mmol/L. Un giorno prima del trapianto, isolotti pancreatici del topo sono isolati dal pancreas donatore di digestione della collagenosi; un minimo di 350 isolotti sono utilizzata per ogni destinatario diabetica. A seconda del rendimento di isolamento dell’isolotto, due o più topi donatore sono utilizzati per ogni destinatario. Dopo coltura durante la notte a 37 ° C, isolotti sono amministrati nel destinatario fegato tramite la vena portale. Dopo la chirurgia, i topi sono protetti in case rosse Makrolon e osservati fino a sono svegli. Questo protocollo gestisce controllo glycemic per 120 giorni in topi syngeneic e 15 giorni in topi allogenici.
Introduction
Trapianto dell’isolotto è un approccio promettente per il trattamento di tipo 1 diabete mellito1. Il primo tentativo di trasferire un frammento del pancreas di pecore in un paziente diabetico è stato effettuato da Watson Williams nel 1893. Tuttavia, un importante passo avanti nel trapianto di insule pancreatiche clinica è stato realizzato con il protocollo di Edmonton, e da allora in poi, una serie di programmi nazionali sono stati sviluppati2. In passato, diversi siti, quali il midollo osseo, borsa omentale, regione intramuscolare, superficie mucosa gastrica, milza e capsula del rene, sono stati esplorati in modelli preclinici, ma il sistema venoso portale è considerato come uno del sito adatto ed efficace per programmi clinici3,4,5,6.
Somministrazione esogena di insulina può essere sostituito dall’infusione dell’isolotto nella vena portale. Questo è considerato un sito preferito, perché l’apporto di ossigeno è paragonabile a quella del pancreas nativo a causa della posizione a valle della confluenza del portale dell’arteria e della vena. Inoltre, c’è una grande superficie, così che la struttura tridimensionale degli isolotti può essere conservata e vascolarizzazione potrebbe essere agevolato5. In un destinatario topo diabetico, 2.000 equivalenti di isolotto umana o suina o mouse 350 isolotti sono adeguati per invertire il stato iperglicemico7,8. Livelli di euglycemic sono stati segnalati per 15 giorni nel modello murino destinatario degli isolotti xenogeneic e nel modello di trapianto allogeneic del mouse-a-mouse e per più di 120 giorni nel trapianto syngeneic del mouse-a-mouse.
Fattori pertinenti per l’efficacia di trapianto dell’isolotto via vena portale sono appropriata anestesia, metodo di puntura e di emostasi9. L’anestesia può essere indotta da inalazione (5% isoflurano) o iniezione (ketamina, xilazina o pentobarbital), e le sostanze sono spesso combinate. Per il controllo della profondità e tempo di anestesia, si dovrebbe prestare attenzione allo stato del mouse, ad esempio il colore della membrana mucosa, palpebra, riflesso corneale, frequenza respiratoria e temperatura corporea. È importante garantire che l’animale non è in difficoltà e che sopravvive l’operazione. La temperatura può essere mantenuta dai dispositivi di riscaldamento differenti, quali termofori, rosso lampadine, ecc A caldo piastra termica è stato utilizzato per mantenere una temperatura di 25-30 ° C tra il mouse e la tabella di funzionamento, che impedisce il verificarsi di ipotermia. I dosaggi degli anestetici sono importanti in quanto tutti loro sono metabolizzati dal fegato, e funzione epatica può essere transitoriamente disordinati dall’infusione della sospensione dell’isolotto. Il punto di puntura ideale per vena portale è la posizione tra la prima e la seconda vena tributaria.
Il numero di isolotti e il volume di iniezione prevista anche influenza l’esito del trapianto, come un volume eccessivo può aumentare la sollecitazione di taglio. Un volume di 0,2 mL è considerato appropriato per trapianto dell’isolotto nella vena portale. La ferita di perforatura (ago 26-gauge) induce emorragia dalla vena portale, che deve essere fermato in modo tempestivo ed efficace. Garza sterile o un dito può essere applicato con una pressione minima presso il sito della puntura per circa 6 minuti per fermare l’emorragia. Presi insieme, portale isolotto iniezione è efficace e fornisce il regolamento sopra i livelli della glicemia in modelli di topo diabetico chimicamente indotta.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, il percorso intraportal di trapianto dell’isolotto è esplorato. Questo protocollo è altamente efficace nell’alleviamento dello stress diabetico e fornisce un’opportunità di approfondimento per esplorare studi di trapianto dell’isolotto. Questo protocollo conferma che circa 350 isolotti murini sono in grado di invertire lo stato iperglicemico. Inoltre, nessuno dei topi morti durante la procedura e controllo glicemico è stato realizzato in tutti i destinatari. Livelli di glucosio nel sangue e peso del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere Gundula Hertl per il suo sostegno.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
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