השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר
Summary
השתלת הלבלב איון היא דרך להשיג normoglycemia על סוכרת מסוג 1. מאמר זה מתמקד בטכניקה השתלת מהנתיב intraportal כדי לשמור על רמות גלוקוז נורמלי בעכברים סוכרתיים.
Abstract
השתלת הלבלב איון להפחית היפרגליקמיה היא מצליחה מאוד בחולדות עם סוכרת בהשפעת כימיקלים. האתר השתלת הנפוץ ביותר השתלת איון ניסיוני הוא הקפסולה כליות. עם זאת, פחות הידוע על האינטראקציה של לנגרהנס עם מרכיבי דם, זה גם הגיוני לנצל את הגישה וריד שער הכבד השתלת איון ניסיוני.
פרוטוקול זה מדגים שיטת השתלת איון intraportal בעכברים עירום NMRI. Streptozotocin (180 מ”ג/ק”ג) מוזרק intraperitoneally לזירוז היפרגליקמיה בעכברים הנמען. הם נחשבים כמו סוכרת ברמת הגלוקוז בדם ללא צום גדול מ- 20 mmol/ל’ יום אחד לפני ההשתלה, העכבר לנגרהנס הם בודדו אותנו מהמתרחש הלבלב התורם על ידי עיכול collagenase; מינימום של 350 איונים מנוצלים לכל נמען סוכרתית. בהתאם התשואה בידוד איון, עכברים התורם שניים או יותר מנוצלים לכל נמען. לאחר לילה תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, איונים מנוהלים לתוך הכבד נמענים דרך וריד שער הכבד. לאחר הניתוח, העכברים מוגן בבתים Makrolon אדום והנצפית עד ערה. פרוטוקול זה שומר על הבקרה הגליקמית עבור 120 ימים בעכברים syngeneic ו- 15 ימים בעכברים allogeneic.
Introduction
השתלת איון היא גישה מבטיחה לטיפול סוג 1 סוכרת1. הניסיון הראשון להעביר קטע הלבלב כבשים לתוך לחולה סוכרת בוצע על ידי ווטסון ויליאמס בשנת 1893. עם זאת, פריצת דרך השתלת איון קליני הושגה עם פרוטוקול אדמונטון, לאחר מכן, סדרה של תוכניות לאומיות היו מפותחות2. בעבר, מספר אתרים, כגון מח העצם, נרתיק עם פגיעה, אזור תוך שרירית, השטח הרירית קיבה, טחול וכן כליה כמוסה, היו בציורו במודלים פרה, אבל וריד נחשב לאחד של אתר מתאים ויעיל עבור תוכניות קליני3,4,5,6.
הממשל אקסוגני של אינסולין יכול להיות מוחלף על ידי אינפוזיה איון לתוך וריד שער הכבד. מצב זה נחשב אתר מועדף בגלל לאספקת החמצן דומה לזו בלבלב יליד בשל המיקום במורד הזרם של המפגש של פורטל עורק, וריד. יתר על כן, יש פני שטח גדול, כך למבנה התלת ממדי של ע עשוי להישמר, vascularization יכול להיות מונחה5. עכבר סוכרתית הנמען, 2,000 בני אדם או חזירי איון מקבילות או העכבר 350 איונים סבירים להפוך את המדינה hyperglycemic7,8. רמות Euglycemic דווחו על 15 ימים במודל עכבר הנמען של איים קטנים xenogeneic, במודל עכבר allogeneic ועל יותר מ 120 ימים בהשתלת syngeneic העכבר-העכבר.
גורמים הקשורה היעילות של השתלת איון דרך וריד שער הכבד הם המתאימים הרדמה, שיטה של דקירה, hemostasis9. הרדמה יכולה להיגרם על ידי שאיפת (5% איזופלוריין) או הזרקה (קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים או פנטוברביטל), החומרים משולבים לעתים קרובות. שליטה על עומק וזמן של הרדמה, תשומת הלב צריך להיות משולם למצב של העכבר, כגון הצבע של קרום רירי, עין מכסה, רפלקס המצמוץ, קצב נשימה, טמפרטורת הגוף. חשוב לוודא כי החיה לא נאבק, הוא שורד את הניתוח. הטמפרטורה יכול להישמר על ידי מכשירי חימום שונים, כגון כריות חימום, אדום-נורות, צלחת תרמיים חמים וכו א שימש כדי לשמור על חום של 25-30 מעלות צלזיוס בין השולחן המבצע, אשר מונע את המופע של העכבר היפותרמיה. המינונים בהרדמה חשובים, כמו כולן הן מטבוליזם על ידי הכבד, תפקוד הכבד עשוי להיות מגרה transiently מאת לעירוי של המתלה איון. נקודת חדירה אידיאלי עבור וריד שער הכבד הוא המיקום בין הווריד אחד מיובליו של הראשון והשני.
מספר איים קטנים ונפח הזרקת המיועד להשפיע גם התוצאה של ההשתלה, כמו אמצעי מופרז עלול להגביר את מאמץ גזירה. אמצעי אחסון 0.2-mL נחשבת מתאימה השתלת איון לתוך וריד שער הכבד. הפצע puncturing (מחט בקוטר 26) גורם לדמם וריד שער הכבד, אשר צריך לעצור באופן מתוזמן ויעיל. גזה סטרילית או אצבע יכול להיות מיושם עם לחץ מינימלי באתר של הניקוב למשך כ 6 דקות לעצור את הדימום. איון ביחד, פורטל לקח זריקה יעיל ומספק רגולציה על רמות הגלוקוז בדם במודלים של העכבר סוכרת כימית המושרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, התוואי intraportal של השתלת איון בחנו. פרוטוקול זה יעיל ביותר להקלת הלחץ סוכרתית ומספק הזדמנות מעמיק לחקור מחקרים השתלת איון. פרוטוקול זה מאשרת כי כ-350 איונים מאתר מסוגלים היפוך המדינה hyperglycemic. יתר על כן, אף אחד העכברים מתו במהלך ההליך, הבקרה הגליקמית הושג לכל הנמענים. משקל הגוף ורמות גל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות Gundula Hertl לתמיכה שלה.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
