Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin
Summary
La transplantation d’îlots pancréatiques est une façon d’atteindre la normoglycémie dans le diabète de type 1. Cet article se concentre sur la technique de transplantation la voie intraporte de maintenir une glycémie normale chez des souris diabétiques.
Abstract
La transplantation d’îlots pancréatiques pour réduire l’hyperglycémie est très réussie chez les rongeurs souffrant de diabète chimiquement induite. Le site de transplantation plus courant dans la transplantation d’îlots expérimentale est la capsule rénale. Toutefois, comme on connaît moins l’interaction des îlots pancréatiques avec les constituants du sang, il est également judicieux d’utiliser l’approche de la veine porte dans la transplantation d’îlots expérimentale.
Ce protocole montre une technique de transplantation îlot intraporte chez la souris nude NMRI. Streptozotocine (180 mg/kg) est injecté par voie intrapéritonéale pour provoquer l’hyperglycémie chez les bénéficiaires. Ils sont considérés comme diabétique à un non-jeûne glycémie supérieures à 20 mmol/L. Un jour avant la greffe, les îlots pancréatiques de souris sont isolés par le pancréas du donneur par digestion de collagénase ; un minimum de 350 îlots sont utilisés par le destinataire diabétique. Selon le rendement d’isolation îlot, souris de donateurs de deux ou plusieurs sont utilisés par le destinataire. Après une culture à 37 ° C, les îlots sont administrés dans le destinataire foie via la veine porte. Après la chirurgie, les souris sont protégées dans des maisons de Makrolon rouges et observées jusqu’à sont éveillés. Ce protocole maintienne un équilibre glycémique pour 120 jours chez les souris syngéniques et 15 jours chez les souris allogéniques.
Introduction
Transplantation d’îlots pancréatiques est une approche prometteuse pour traiter 1 diabète sucré de type1. La première tentative de transfert d’un fragment du pancréas de moutons dans un patient diabétique a été interprétée par Watson Williams en 1893. Cependant, une percée majeure dans la transplantation d’îlots clinique a été réalisée avec le protocole d’Edmonton, et par la suite, une série de programmes nationaux ont été développés2. Dans le passé, plusieurs sites, comme la moelle osseuse, pochette épiploïques, région intramusculaire, surface de la muqueuse gastrique, rate et capsule rénale, ont été explorés dans les modèles précliniques, mais le système veineux portal est considéré comme un des sites adaptés et efficaces pour les programmes cliniques3,4,5,6.
L’administration d’insuline exogène peut être remplacée par perfusion d’îlot dans la veine porte. Ceci est considéré comme un site privilégié parce que l’alimentation en oxygène est comparable à celle du pancréas natif en raison de la situation en aval du confluent du portail artère et veine. De plus, il y a une grande surface, afin de préserver la structure tridimensionnelle des îlots peut-être être et vascularisation pourrait être facilitée5. Dans une souris diabétique bénéficiaire, 2 000 équivalents humains ou porcins îlot ou souris 350 îlots sont adéquates pour renverser l’État hyperglycémique7,8. Euglycémique niveaux ont été rapportés pendant 15 jours chez la souris destinataire des îlots xénogéniques et dans le modèle de souris allogénique et plus de 120 jours à la transplantation à-souris syngénique.
Facteurs pertinents à l’efficacité de la transplantation d’îlots via la veine porte sont appropriée anesthésie, méthode de ponction et hémostase9. L’anesthésie peut être induite par l’inhalation (5 % isoflurane) ou injection (kétamine, xylazine ou pentobarbital), et les substances sont souvent combinés. Pour le contrôle de la profondeur et le temps de l’anesthésie, convient à l’état de la souris, telles que la couleur de la muqueuse, paupière, réflexe cornéen, la fréquence respiratoire et la température corporelle. Il est important de s’assurer que l’animal n’est pas mal et qu’il survit à l’opération. La température peut être maintenue par des appareils de chauffage différents, tels que les coussins chauffants, ampoules d’éclairage rouge, etc. A chaud plaque thermique a été utilisé pour maintenir une température de 25-30 ° C entre la souris et la table d’opération, qui empêche l’apparition de hypothermie. Les dosages des anesthésiques sont importants, car chacun d’eux sont métabolisés par le foie et la fonction hépatique peut être transitoirement désordonnée par l’infusion de la suspension de l’îlot. Le point idéal de ponction de la veine porte est la position entre la première et la deuxième veine affluent.
Le nombre d’îlots et le volume d’injection prévu également influence le résultat de la transplantation, comme un volume trop élevé peut augmenter la contrainte de cisaillement. Un volume de 0,2 mL est jugé approprié pour la transplantation d’îlots dans la veine porte. La blessure de perforation (aiguille de calibre 26) induit des saignements de la veine porte, qui doit être arrêté de façon rapide et efficace. Gaze stérile ou un doigt peut être appliqué avec une pression minimale sur le site de la piqûre pendant environ 6 minutes arrêter le saignement. Prises îlot ensemble, portail injection est efficace et fournit le règlement sur le taux de glucose sanguin chez les modèles murins diabétique induite chimiquement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, la route intraporte de la transplantation d’îlots pancréatiques est explorée. Ce protocole est très efficace pour soulager le stress diabétique et approfondie permet d’explorer études de transplantation d’îlots pancréatiques. Ce protocole confirme qu’environ 350 îlots murins sont capables d’inverser l’État hyperglycémique. Par ailleurs, aucune des souris sont morts au cours de la procédure, et contrôle de la glycémie ont été accompli dans tous les destinataires. Taux de gluc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Gundula Hertl pour son soutien.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
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