Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse
Summary
Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.
Abstract
Transplante de ilhotas pancreáticas para reduzir a hiperglicemia é altamente bem sucedido em roedores com diabetes quimicamente induzida. O local mais comum de transplante em transplante experimental de ilhotas é a cápsula renal. No entanto, quanto menos se sabe sobre a interação das ilhotas pancreáticas com componentes do sangue, também faz sentido utilizar a abordagem da veia porta em transplante experimental de ilhotas.
Este protocolo demonstra uma técnica de transplante de ilhotas intraportal em camundongos NMRI. Estreptozotocina (180 mg/kg) é injetada intraperitonealmente para induzir hiperglicemia em ratos do destinatários. Eles são considerados como diabético a um nível de glicose do sangue não-jejum maiores que 20 mmol/L. Um dia antes da transplantação, ilhotas pancreáticas do mouse são isoladas do pâncreas de doador por digestão de colagenase; um mínimo de 350 ilhéus são utilizados por beneficiário diabético. Dependendo do rendimento de isolamento ilhéu, dois ou mais ratos de doador são utilizados por beneficiário. Depois da cultura durante a noite a 37 ° C, ilhotas são administradas para o destinatário fígado através da veia portal. Após a cirurgia, os ratos são protegidos em casas de Makrolon vermelhas e observados até está acordado. Esse protocolo mantém controle glicêmico para 120 dias em camundongos syngeneic e 15 dias em ratos alogênico.
Introduction
Transplante de ilhotas é uma abordagem promissora para tratar o tipo 1 diabetes mellitus1. A primeira tentativa de transferir um fragmento do pâncreas de ovelhas em um paciente diabético foi realizada por Watson Williams em 1893. No entanto, um grande avanço em transplante clínico ilhéu foi alcançado com o protocolo de Edmonton, e daí em diante, uma série de programas nacionais foram desenvolvidos2. No passado, vários sites, tais como a medula óssea, bolsa omental, região intramuscular, superfície da mucosa gástrica, baço e cápsula renal, foram explorados em modelos pré-clínicos, mas o sistema venoso portal é considerado como um do local adequado e eficaz para programas clínicos3,4,5,6.
Administração exógena de insulina pode ser substituída por infusão ilhéu na veia portal. Isto é considerado um local preferido, porque o suprimento de oxigênio é comparável ao que no pâncreas nativo devido a localização a jusante da confluência do portal artéria e veia. Além disso, há uma grande área de superfície, para que a estrutura tridimensional dos ilhéus pode ser preservada, e vascularização poderia ser facilitado5. Em um rato diabético destinatário, 2.000 equivalentes humanos ou suínos ilhéu ou 350 rato ilhotas são suficientes para reverter o estado hiperglicêmico7,8. Euglicêmico níveis foram relatados por 15 dias no modelo destinatário de rato de ilhotas xenogénicas e no modelo do rato para alogênico e por mais de 120 dias no syngeneic-rato para transplante.
Fatores relevantes para a eficácia do transplante de ilhotas através da veia porta são anestesia adequada, método de punção e hemostasia9. Anestesia pode ser induzida por inalação (5% de isoflurano) ou injeção (cetamina, xilazina ou pentobarbital), e as substâncias são muitas vezes combinadas. Para controle da profundidade e tempo de anestesia, deve ser dada atenção ao estado do mouse, como a cor da membrana mucosa, tampa do olho, reflexo corneal, frequência respiratória e temperatura corporal. É importante assegurar que o animal não está se esforçando e que sobreviva a operação. A temperatura pode ser mantida por aquecimento de diferentes dispositivos, como almofadas de aquecimento, lâmpadas de luz vermelha, etc. A quente chapa térmica tem sido usada para manter uma temperatura de 25-30 ° C entre o rato e a mesa de operação, o que impede a ocorrência de hipotermia. As doses dos anestésicos são importantes, porque todos eles são metabolizados pelo fígado, e a função hepática pode ser transitoriamente desordenada por infusão de suspensão o ilhéu. O ponto de punção ideal para a veia porta é a posição entre a primeira e a segunda veia tributário.
O número de Ilhéus e o volume de injeção se destina também influencia o resultado do transplante, como um volume excessivo pode aumentar a tensão de cisalhamento. Um volume de 0,2 mL é considerado adequado para o transplante de ilhotas na veia portal. A ferida puncionar (agulha de calibre 26) induz sangramento da veia portal, que precisa ser interrompido de forma oportuna e eficaz. Gaze estéril ou um dedo pode ser aplicado com pressão mínima no local da punção por cerca de 6 min parar o sangramento. Tomados juntos, portal ilhéu injeção é eficaz e oferece o Regulamento sobre níveis de glicose em modelos do rato diabético quimicamente induzida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, a rota intraportal de transplante de ilhotas é explorada. Este protocolo é altamente eficaz no alívio de estresse diabética e oferece uma oportunidade em profundidade para explorar estudos de transplante de ilhotas. Este protocolo confirma que cerca de 350 murino ilhotas são capazes de reverter o estado hiperglicêmico. Além disso, nenhum dos ratos morreu durante o procedimento, e o controle glicêmico foi alcançado em todos os destinatários. Níveis de glicose no corpo peso e sangue foram gravados …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós gostaríamos de reconhecer Gundula Hertl o seu apoio.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
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