Intraportal transplantatie van de alvleesklier eilandjes in Mouse Model
Summary
Alvleesklier islet transplantatie is een manier om normoglycemia bij type 1 diabetes. Dit artikel richt zich op de transplantatie-techniek via de intraportal route om normale glucoseniveaus in diabetesmuizen te handhaven.
Abstract
Alvleesklier islet transplantatie te verminderen van hyperglycemie is zeer succesvol in knaagdieren met chemisch geïnduceerde diabetes. De meest voorkomende transplantatie site in experimentele islet transplantatie is de capsule van de nier. Echter zoals minder is gekend over de interactie van de alvleesklier eilandjes met bloedbestanddelen, zinvol het ook om gebruik te maken van de aanpak van de portal vein in experimentele islet transplantatie.
Dit protocol toont een intraportal islet transplantatie techniek in NMRI naakt muizen. Streptozotocin (180 mg/kg) is intraperitoneally geïnjecteerd om het induceren van hyperglycemie in ontvangende muizen. Ze worden beschouwd als diabeticus op een niet-vasten bloedglucose niveau groter is dan 20 mmol/L. Een dag voorafgaand aan de transplantatie, zijn muis alvleesklier eilandjes geïsoleerd uit de alvleesklier donor door collagenase spijsvertering; minimaal 350 eilandjes worden gebruikt per diabetische ontvanger. Afhankelijk van de opbrengst van de isolatie islet, worden twee of meer donor muizen gebruikt per ontvanger. Na overnachting cultuur bij 37 ° C, zijn eilandjes in de ontvangende lever via de portal ader toegediend. Na de operatie, de muizen zijn beschermd in rode Makrolon huizen en waargenomen tot wakker zijn. Dit protocol behoudt een glycemische controle voor 120 dagen in syngeneic muizen en 15 dagen bij allogene muizen.
Introduction
Islet Transplantatie is een veelbelovende aanpak voor de behandeling van type 1 diabetes mellitus1. De eerste poging om te brengen een alvleesklier fragment van schapen naar een diabetes patiënt werd uitgevoerd door Watson Williams in 1893. Echter een belangrijke doorbraak in klinische islet transplantatie werd bereikt met de Edmonton-protocol, en daarna, een reeks van nationale programma’s waren ontwikkelde2. In het verleden verschillende sites, zoals het beenmerg, omental etui, intramusculaire regio, mucosal maagzijde, milt en nieren capsule, in preklinische modellen werden onderzocht, maar de portal veneuze systeem wordt beschouwd als een van de geschikte en effectieve site voor klinische programma’s3,4,5,6.
Exogene toediening van insuline kan worden vervangen door islet infuus in de ader van de portal. Dit wordt beschouwd als een voorkeur site omdat de zuurstoftoevoer vergelijkbaar met die in de inheemse alvleesklier dankzij de ligging stroomafwaarts van de samenvloeiing van de portal slagader en ader is. Bovendien, er is een grote oppervlakte, zodat de driedimensionale structuur van de eilandjes kan worden behouden, en vascularisatie zou vergemakkelijkt5. In een ontvangende diabetische muis, 2.000 mens of varkens islet equivalenten of 350 muis zijn eilandjes voldoende om het omkeren van de7,hyperglycemic staat8. Euglycemic niveaus werden gemeld voor 15 dagen in de ontvangende muismodel van XENOGENECELLEN eilandjes en in de allogene muis-naar-mouse model en voor meer dan 120 dagen in de syngeneic transplantatie van de muis-tot-muis.
Factoren die relevant zijn voor de werkzaamheid van islet transplantatie via portal vein zijn passende anesthesie, methode van lekke band en hemostase9. Verdoving kan worden opgewekt door inademing (5% Isofluraan) of injectie (ketamine, xylazine of pentobarbital), en de stoffen worden vaak gecombineerd. Voor controle van de diepte en tijd van de verdoving, moet aandacht worden besteed aan de staat van de muis, zoals de kleur van de slijmvliezen, ooglid, hoornvlies reflex, ademhaling en lichaamstemperatuur. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het dier niet worstelt en dat het de operatie overleeft. De temperatuur kan worden gehandhaafd door verwarming van de verschillende apparaten, zoals verwarmingskussens, rode lampen, etc. A warme thermische plaat is gebruikt om een temperatuur van 25-30 ° C tussen de muis en de operatie tafel, waardoor het voorkomen van onderkoeling. De doseringen van de verdoving zijn belangrijk, omdat ze allemaal door de lever worden gemetaboliseerd en hepatische functie Transient worden door de infusie van de schorsing van het eilandje. ontregelde kan De ideale punctie punt voor de portal-ader is de positie tussen de eerste en tweede zijrivier ader.
De uitkomst van de transplantatie, beïnvloeden het aantal eilandjes en het beoogde geïnjecteerde volume ook zoals een overmatig volume de schuifspanning verhogen kan. Een volume 0,2 mL is geschikt geacht voor islet transplantatie in de ader van de portal. De puncturing wond (26-gauge naald) induceert bloeden uit de ader van de portal, die moet worden gestopt in een tijdige en effectieve manier. Steriel gaas of een vinger kan worden toegepast met minimale druk op de site van de lekke band voor ongeveer 6 min om te stoppen met het bloeden. Genomen samen, portal islet injectie is effectief en biedt van verordening ten opzichte van de niveaus van de glucose van het bloed in chemisch geïnduceerde diabetische Muismodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie, is de intraportal route van islet transplantatie onderzocht. Dit protocol is zeer efficiënt in het verlichten van diabetische stress en biedt een uitgebreide mogelijkheid om te verkennen islet transplantatie studies. Dit protocol bevestigt dat ongeveer 350 lymfkliertest eilandjes geschikt zijn voor het omkeren van de hyperglycemic staat. Bovendien, geen van de muizen overleed tijdens de procedure, en glycemische controle werd bereikt in alle geadresseerden. Lichaam gewicht en bloed glucoseniveaus waren r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen erkennen Gundula Hertl voor haar steun.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
