Intraportal transplantasjon av bukspyttkjertelen holmer i musemodell
Summary
Bukspyttkjertelen Holme transplantasjon er en måte å oppnå normoglycemia i type 1 diabetes. Denne artikkelen fokuserer på transplantasjon teknikken gjennom intraportal ruten å opprettholde normale blodsukkeret hos diabetiker mus.
Abstract
Bukspyttkjertelen Holme transplantasjon å redusere hyperglykemi er svært vellykket i gnagere med kjemisk indusert diabetes. Webområdet for vanligste transplantasjon i eksperimentell Holme transplantasjon er nyre kapselen. Men som mindre er kjent om samspillet av bukspyttkjertelen holmer med blod bestanddeler, fornuftig det også å bruke portalen blodåre tilnærming i eksperimentell Holme transplantasjon.
Denne protokollen demonstrerer en intraportal Holme transplantasjon teknikk i NMRI naken mus. Streptozotocin (180 mg/kg) injiseres intraperitoneally for å indusere hyperglykemi i mottakerens mus. De blir betraktet som diabetiker på en ikke-faste blodsukkernivå større enn 20 mmol/L. Én dag før transplantasjon, er musen bukspyttkjertelen holmer isolert fra donor bukspyttkjertelen av collagenase fordøyelse; minst 350 holmer benyttes per diabetiker mottaker. Avhengig av Holme isolasjon avkastningen, benyttes to eller flere donor mus per mottaker. Etter natten kultur på 37 ° C administreres holmer i mottakerens leveren via portalen blodåre. Etter operasjonen, mus er beskyttet i rødt Makrolon hus og observert til er våken. Denne protokollen opprettholder glykemisk kontroll for 120 dager i syngeneic mus og 15 dager i allogene mus.
Introduction
Holme transplantasjon er en lovende tilnærming til behandling av type 1 diabetes mellitus1. Første forsøk på å overføre et sauer bukspyttkjertelen fragment til en diabetiker pasient ble utført av Watson Williams i 1893. Men et stort gjennombrudd i klinisk Holme transplantasjon ble oppnådd med Edmonton-protokollen, og deretter en rekke nasjonale programmer ble utviklet2. I siste, flere steder, som benmargen, omental veske, intramuskulær regionen, mage slimhinnen, milt og nyre capsule, ble undersøkt i preklinisk modeller, men portalen venøse systemet er regnet som en av området passer og effektiv i kliniske programmer3,4,5,6.
Eksogene administrasjon av insulin kan erstattes av Holme infusjon i portalen blodåre. Dette er ansett som en foretrukket sted fordi oksygentilførsel er sammenlignbar med i native bukspyttkjertelen beliggenhet nedstrøms av samløpet av portalen arterien og venen. Dessuten, det er et stort område, slik at den tredimensjonale strukturen i øyene kan bli bevart, og endometrial blodkar kunne tilrettelagt5. I en mottaker diabetiker mus, 2000 mennesker eller svin Holme ekvivalenter eller 350 musen er holmer tilstrekkelig å reversere den hyperglycemic state7,8. Euglycemic nivåer ble rapportert 15 dager i musen mottaker modellen xenogeneic holmer og allogene musen til mus modell, og i mer enn 120 dager i syngeneic musen til mus transplantasjon.
Faktorer relevant for effekten av Holme transplantasjon via portalen blodåre er riktig anestesi, punktering og hemostasen9. Anestesi kan være forårsaket av innånding (5% isoflurane) eller injeksjon (Ketamin, xylazine eller pentobarbital), og stoffer er ofte kombinert. Kontroll av dybden og tidspunktet for anestesi, bør oppmerksomhet vies i delstaten musen, for eksempel fargen på slimhinnene, øye lokket, hornhinnen refleks, pustefrekvens og kroppstemperatur. Det er viktig å sikre at dyret ikke er sliter og at det overlever operasjonen. Temperaturen kan opprettholdes av ulike oppvarming enheter, for eksempel oppvarming pads, red lyspærer, etc. A varm varmeplaten er brukt til å opprettholde en temperatur på 25-30 ° C mellom musen og tabellen operasjon, som hindrer forekomst av nedkjøling. Doser av anestesi er viktig, som alle er metaboliseres i leveren, og nedsatt funksjon kan være transiently uordnede av tilførsel av Holme suspensjon. Det ideelle punktering punktet for portalen blodåre er plasseringen mellom første og andre sideelv venen.
Antall holmer og tiltenkte injeksjon volumet også påvirke utfallet av transplantasjon, høyt volum kan øke skjæring stress. En 0,2-mL volum anses hensiktsmessig for Holme transplantasjon i portalen blodåre. Puncturing såret (26-gauge p) induserer blødning fra portalen blodåre, som må stoppes på en riktig og effektiv måte. Sterilt gasbind eller en finger kan brukes med minimal trykk på stedet av punktering i ca 6 min å stoppe blødningen. Tatt sammen, portalen Holme injeksjon er effektivt og gir regulering over blodsukkernivået i kjemisk indusert diabetiker musen modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien er intraportal ruten Holme transplantasjon utforsket. Denne protokollen er svært effektiv i lindrende diabetiker stress og grundig mulighet å utforske Holme transplantasjon studier. Denne protokollen bekrefter at ca 350 murine holmer er i stand til å reversere hyperglycemic staten. Videre ingen av musene døde under prosedyren og glykemisk kontroll ble oppnådd i alle mottakere. Kroppen vekt og blod glucose høyder innspilt regelmessig for å gjenspeile den kompetanse, standard og funksjonalitet av tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å erkjenne Gundula Hertl for hennes støtte.
Materials
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo – Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
