Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.
Abstract
Die intime Interaktion zwischen Pflanze Host und dem damit verbundenen Mikroorganismen ist von entscheidender Bedeutung bei der Bestimmung der Pflanze Fitness und verbesserte Toleranz gegenüber abiotischem Stress und Krankheiten fördern kann. Als die Pflanze Microbiome hochkomplexe, Low Cost sein, werden Hochdurchsatz-Methoden wie Amplikons-basierte Sequenzierung der 16 s rRNA-gen oft bevorzugt zur Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung und Vielfalt. Allerdings ist die Auswahl der geeigneten Methodik bei der Durchführung von solchen Experimenten entscheidend zur Reduzierung von Verzerrungen, die die Analysen und Vergleiche zwischen Proben und Studien erschweren können. Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine standardisierte Methodik für die Erfassung und Extraktion von DNA aus Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben. Darüber hinaus wir markieren eine etablierte 16 s rRNA Amplikons Sequenzierung Pipeline, die für die Erforschung der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften in diesen Proben erlaubt, und kann leicht für andere Markergene angepasst werden. Diese Pipeline wurde für eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter Sorghum, Mais, Weizen, Erdbeere und Agave, validiert und kann helfen, Probleme im Zusammenhang mit der Kontamination von pflanzlichen Organellen zu überwinden.
Introduction
Pflanze-assoziierten mikrobiome bestehen aus dynamischen und komplexen mikrobieller Gemeinschaften bestehend aus Bakterien, Archaeen, Viren, Pilze und andere eukaryotischen Mikroorganismen. Neben ihrer gut untersuchte Rolle bei der Entstehung von Pflanzenkrankheiten können Anlage-assoziierten Mikroben auch Pflanzengesundheit positiv durch Verbesserung der Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress, Förderung der nährstoffverfügbarkeit und Pflanzenwachstum durch Verbesserung die Produktion von Phytohormonen. Aus diesem Grund besteht besonderes Interesse bei der Charakterisierung der Taxa, die Pflanze Wurzel Endospheres, rhizosphären und das umgebende Erdreich zugeordnet. Während einige Mikroben isoliert im Labor erzeugten Medien kultiviert werden können, viele nicht, zum Teil, weil sie auf Symbiotische Beziehungen mit anderen Mikroben berufen können, wachsen sehr langsam, oder erfordern Bedingungen, die in einer Testumgebung nicht repliziert werden können. Weil es die Notwendigkeit für den Anbau umgeht und relativ kostengünstig und hohem Durchsatz ist, Sequenz-basierte phylogenetische Profilierung der Umwelt- und Host-assoziierten mikrobielle Proben eine bevorzugte Methode für die Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft geworden Zusammensetzung.
Die Auswahl der geeigneten Sequenziertechnologien zur Verfügung gestellt von verschiedenen nächste Generation sequencing (NGS) Plattformen1 richtet sich auf die Bedürfnisse der Nutzer, mit wichtigen Faktoren wie: gewünschte Abdeckung, Amplifikate Länge erwartet Gemeinschaft Vielfalt sowie Sequenzierung Fehlerquote lesen-Länge und die Kosten-pro-Lauf/Megabase. Eine weitere Variable, die in Amplikons-basierte Sequenzierung Experimenten berücksichtigt werden muss ist welches gen verstärkt werden und welche Primer verwendet werden. Bei der Gestaltung oder der Wahl der Primer, sind Forscher oft gezwungen, Kompromisse zwischen der Universalität der Verstärkung und die taxonomische Auflösung aus der daraus resultierenden Amplifikate erreichbar machen. Aus diesem Grund wählte diese Arten von Studien oft Primer und Marker, die selektiv bestimmte Teilmengen der das Mikrobiom abzielen. Beurteilung der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften geschieht häufig durch Sequenzierung eine oder mehrere der hypervariablen Regionen der bakteriellen 16 s rRNA gen2,3. In dieser Studie beschreiben wir eine Amplikons basierte Sequenzierung Protokoll entwickelt für eine NGS-Plattform dieser Ziele der 500 bp V3-V4 Region der bakteriellen 16 s rRNA-gen, ermöglicht eine breite Verstärkung der bakteriellen Taxa und gleichzeitig ausreichend Variabilität, unterscheiden Sie zwischen verschiedenen Taxa. Darüber hinaus kann dieses Protokoll problemlos für die Verwendung mit anderen Primer-Sets, wie die Ausrichtung auf die ITS2 Marker von Pilzen oder 18 s rRNA Untereinheit der Eukaryoten angepasst werden.
Während andere Ansätze wie Schrotflinte Metagenomik, Metatranscriptomics und einzellige Sequenzierung, andere Vorteile einschließlich gelöst mikrobieller Genome und mehr direkte Messung des Community-Funktion bieten, sind diese Techniken in der Regel mehr teuer und rechenintensiven als die phylogenetische Profilierung hier4beschrieben. Darüber hinaus sind durchführen Schrotflinte Metagenomik und Metatranscriptomics auf Wurzelproben ergibt sich einen großen Prozentsatz der Zugehörigkeit zu dem Host Pflanzengenom liest, und Methoden, um diese Einschränkung zu umgehen immer noch entwickelten5,6.
Wie bei jeder experimentelle Plattform kann Amplikons-basierten profiling eine Reihe von potenziellen Verzerrungen einführen, die bei der experimentellen Design und Daten-Analyse berücksichtigt werden sollten. Dazu gehören die Methoden der Probenentnahme, DNA-Extraktion, Auswahl der PCR Primer und wie Bibliothek Vorbereitung durchgeführt wird. Verschiedene Methoden können die nutzbare erzeugte Datenmenge erheblich beeinträchtigen und können auch behindern die Bemühungen, Ergebnisse von Studien zu vergleichen. Zum Beispiel die Methode zur Entfernung von Rhizosphäre Bakterium7 und die Verwendung von verschiedenen Fördertechniken oder Wahl der DNA Extraktion Kits8,9 haben gezeigt, dass erhebliche Auswirkungen nachgelagerte Analyse führt zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen in Bezug auf die Mikroben Gegenwart und ihrer relativen Häufigkeiten sind. Seit der Amplifikate basierende Profilerstellung angepasst werden kann, kann es schwierig sein, Vergleiche über Studien. Die Erde Microbiome Projekt hat vorgeschlagen, dass die Entwicklung eines standardisierten Protokolls als Mittel zur Minimierung der Variabilität, verursacht durch die Anwendung der Forscher komplexe Systeme wie die Pflanze-assoziierten Microbiome profitieren würden verschiedene Methoden zwischen Studien10,11. Hier diskutieren wir viele der oben genannten Themen und bieten Anregungen, best practices-wo angebracht.
Das Protokoll zeigt den Prozess der Erhebung Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben aus Sorghum bicolor und Extraktion von DNA mit Hilfe einer etablierten DNA-Isolierung Kit11. Darüber hinaus enthält unser Protokoll einen detaillierte Amplikons Sequenzierung Workflow, mit Hilfe einer häufig eingesetzten NGS-Plattform zur Bestimmung der Struktur der bakteriengemeinschaften12,13,14. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in einer Vielzahl von Pflanze-Hosts in einer kürzlich veröffentlichten Studie der Rhizosphäre, Wurzeln und verbundenen Böden 18 Monocot Arten einschließlich Sorghum bicolor, Zea Mays, und Triticum Aestivum15validiert. Diese Methode ist auch für die Verwendung mit anderen Markergene validiert worden, wie durch seine erfolgreiche Bewerbung zum Studium der Pilzen ITS2 Markergens in Studien der Agave Microbiome16,17 und Erdbeer Microbiome 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zeigt eine etablierte Pipeline Wurzel Endosphere, Rhizosphäre und Boden mikrobiellen Gemeinschaft Kompositionen aus Bereich Probenahme, Probenaufbereitung und nachgelagerte Sequenzierung zu erkunden. Studium Wurzel-assoziierten mikrobiome präsentiert einzigartige Herausforderungen aufgrund teilweise die Schwierigkeiten bei der Probenahme aus dem Boden. Böden sind sehr variabel in Bezug auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften und unterschiedlichen Bodenverhältnissen können von nur wenigen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D) finanziert. TS wird durch die NSF Graduate Research Fellowship Program unterstützt.
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
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