探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出
Summary
ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス データを取得するためのプロトコルについて述べる。この情報は、組成やプラント関連の微生物群集の多様性を調査するため、植物種の広い範囲での使用に適しています。
Abstract
植物宿主と病原性菌の親密な相互作用は植物の適応度を決定する上で重要な非生物的ストレスや病気に対する耐性を改善を促進することができます。工場マイクロバイは、非常に複雑な低コストにすることができます、私アンプリコン ベース 16S rRNA 遺伝子の塩基配列決定など高スループット方法が多いその微生物の組成と多様性を特徴付けるため。しかし、そのような実験を行う際の適切な方法の選択は、難しい分析とサンプルと研究間の比較を行うことができますバイアスを減らすため重要です。このプロトコルは、コレクション、土壌、根圏、およびルート サンプルからの DNA の抽出のための標準化された方法論を詳しく説明します。さらに、我々 はこれらのサンプルの細菌群集組成の調査は、確立された 16S rRNA 増幅シーケンス パイプラインを強調表示し、他のマーカー遺伝子のため簡単に適応することができます。このパイプラインは、ソルガム、トウモロコシ、小麦、イチゴ、アガベを含む植物種の様々 な検証されている、植物細胞小器官からの汚染に関連する問題を克服するを助けることができます。
Introduction
プラント関連内細菌叢解析は細菌、古細菌、ウイルス、菌類および他の真核微生物から成る動的で複雑な微生物群集から成っています。よく研究植物の病気の原因ではなく、植物共生微生物できますも積極的に影響を与える植物の健康によって生物的・非生物的ストレス耐性の向上、栄養アベイラビリティを推進・強化による植物の成長植物ホルモンの生産。このため、特定の関心は植物根 endospheres、根圏、周辺土壌と関連付ける分類群を特徴付けるに存在します。一方、いくつかの微生物は、生成されたメディアを研究室で分離培養することができます、多くはできない、他の微生物と共生関係に依存している場合がありますので、一部非常にゆっくり育つまたはラボ環境では再現できない条件を必要とします。栽培の必要性を回避できますので、比較的安価な高スループット シーケンスを用いた系統プロファイリング環境とホスト関連付けられている微生物サンプルの微生物群集を試金するため最寄り方法となっています。組成物。
次世代シークエンシング (NGS) のプラットフォーム1各種によって提供される適切なシーケンス テクノロジーの選択は、重要な要因を含むユーザーのニーズに依存して: 必要なカバレッジ、私アンプリコン長さ予想コミュニティ多様性と同様、誤り率、読み取りの長さ、および、コスト-あたり-実行/megabase のシーケンスします。私アンプリコン ベースのシーケンス実験で考慮する必要があるもう一つの変数がどのような遺伝子が増幅され、どのようなプライマーが使用されます。設計またはプライマーを選択するとき、研究者は結果の産物から達成可能な増幅の普遍性と分類学的解像度のトレードオフを作るを強いられる。このため、研究のこれらのタイプは、しばしばプライマーと、マイクロバイの特定のサブセットを選択的にターゲット マーカーを選んだ。細菌群集組成の評価は一般的に細菌の 16S rRNA 遺伝子2,3の超可変領域の 1 つ以上のシーケンスで実行します。本研究では、私アンプリコン ベースについて述べるシーケンス プロトコルはそのターゲット、500 bp V3 V4 の領域に十分な可変性を提供しながら細菌種の広範な増幅を可能にする細菌の 16S rRNA 遺伝子の NGS プラットフォーム用に開発。異なる分類群の間を区別します。さらに、このプロトコルは簡単に他のプライマー セットなどの菌類の ITS2 マーカーや真核生物の 18S rRNA サブユニットをターゲットで使用するために適応できます。
他に近づくような散弾銃メタゲノム、メタトランスクリプトミクス、および単一セルの配列を提供する解決の微生物ゲノムとコミュニティ機能のより直接測定を含む他の利点と、これらの技術が通常より多く高価で、ここで説明した系統プロファイリング4よりも計算量の多い。また、宿主植物ゲノムに属する読み取りの大部分をもたらすルート サンプルに散弾銃メタゲノムおよびメタトランスクリプトミクスを実行して、この制限を克服する方法はまだ開発5,6をされています。
実験プラットフォームでも私アンプリコン ベースのプロファイリングは、実験デザインとデータ解析時に考慮すべき潜在的なバイアスの数を導入できます。検体の採取、DNA 抽出、PCR のプライマーの選択およびライブラリの準備を実行する方法のメソッドが含まれます。さまざまな方法は、生成されると、使用可能なデータの量に大きく影響することができますや、また研究間で結果を比較するための努力を妨げることができます。たとえば、根圏細菌7と異なる抽出技術の使用または DNA 抽出キット8,9の選択を除去する方法につながる下流解析に大きく影響する示されています。異なる結論に関して、微生物が存在し、彼らの相対的な存在量。私アンプリコン ベースのプロファイリングをカスタマイズすることができます、ので研究間で比較することが挑戦することができます。地球マイクロバイ プロジェクトのアプリケーションによって引き起こされる変動を最小限に抑える手段として標準化されたプロトコルの開発からプラント関連マイクロバイなど複雑なシステムを調査している研究が恩恵を示唆しています。研究10,11の間さまざまな方法。ここでは、我々 は上記のトピックの多くについて説明し、場所をベスト プラクティスとして提供提案が適切な。
プロトコルは、ソルガム確立された DNA 分離キット11を使用して抽出 DNA からの収集土、根、およびルート サンプル処理を示します。さらに、我々 のプロトコルには、細菌群集12,13,14の構造を決定する一般的利用 NGS プラットフォームを使用して詳細な私アンプリコン シーケンス ワークフローが含まれています。このプロトコルは、根、根、ソルガム、トウモロコシ、およびコムギの15を含む 18 の単子葉種の関連付けられている土壌の最近出版された調査で植物のホストの広い範囲で使用するために検証されています。このメソッドが他のマーカー遺伝子を使用も検証されたリュウゼツラン マイクロバイ16,17いちごマイクロバイに関する研究真菌 ITS2 マーカー遺伝子を勉強への適用によって示されるように18。
Protocol
1. 収集とルート Endosphere、根、土壌試料の分離 滅菌オートクレーブ純水 (サンプルあたりの水の少なくとも 90 mL) フィールドを入力する前に。着生植物の除去バッファー (サンプルあたり少なくとも 25 mL) を準備するには、1 L の滅菌水に KH2PO4の 6.75 g、K2HPO4、8.75 g およびトリトン X-100 の 1 mL を追加します。0.2 μ m の細孔径を持つ真空フィルターを使用し…
Representative Results
推奨されるプロトコルを実行する必要があります結果、データセットの各サンプルに戻る一致し、いずれか細菌に代入することができますインデックス付きのペアエンド リードの操作分類単位 (乙) または順序の変形 (ESV、増幅とも呼ばれますシーケンス バリアント (ASV) と sub-operational 分類単位 (sOTU)) は、下流の分析によって異なります。高品質シーケンス データを?…
Discussion
このプロトコルは、ルート endosphere、根、およびサンプル処理し、下流配列にサンプリング、フィールドからの土壌微生物群集組成の基礎の確立されたパイプラインを示します。勉強ルート関連内細菌叢解析特有の課題、ため一部サンプリングの固有の難しさへの土壌から。土壌は非常に物理的・化学的性質の面で変数と異なる土壌条件はわずか数ミリ28,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国農務省アルス (CRIS 2030-21430-008-00D) によって賄われていた。TS は、NSF 大学院研究フェローシップ ・ プログラムによってサポートされます。
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
Cite This Article
Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).