루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출
Summary
여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.
Abstract
공장 호스트와 관련 된 미생물의 친밀 한 상호작용 공장 피트 니스, 결정에 중요 한 이며 abiotic 스트레스와 질병을 향상 된 공차를 육성 하실 수 있습니다. 매우 복잡 한, 낮은-비용 식물 미생물 수, 16S rRNA 유전자의 amplicon 기반 시퀀싱 등 높은 처리량 방법의 미생물 조성과 다양성 특성화에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 이러한 실험을 실시 하는 경우 적절 한 방법론의 선택이 어려운 분석 및 샘플 연구 사이의 비교를 만들 수 있는 편견을 감소 시키기를 위해 중요 합니다. 이 프로토콜 수집 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플에서 DNA 추출에 대 한 표준화 된 방법론을 세부 사항에 설명합니다. 또한, 우리이 샘플에서 세균성 지역 사회 구성의 탐사를 허용 하는 기초가 튼튼한 16S rRNA amplicon 시퀀싱 파이프라인을 선택 하 고 다른 마커 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 파이프라인 식물 종, 사탕수수, 옥수수, 밀, 딸기, 그리고 용 설 란, 등의 다양 한 검증 되었습니다 그리고 식물 세포에서 오염과 관련 된 문제를 극복 하는 것을 도울 수 있다.
Introduction
역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.
차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼1 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 따라 포함 하는 중요 한 요소: 원하는 범위, amplicon 길이, 예상 커뮤니티 다양성, 뿐만 아니라 오류 속도, 읽기-길이, 그리고는 비용-당-실행/megabase 시퀀싱. Amplicon 기반 시퀀싱 실험에서 고려 되어야 또 다른 변수 어떤 유전자 증폭 될 것 이며 어떤 뇌관을 사용 됩니다. 때 설계 또는 뇌관을 선택, 연구 결과 amplicons에서 달성 증폭의 보편성과 분류학 해상도 간의 절충이 종종 밖에 없습니다. 이러한 이유로 이러한 유형의 연구는 자주 뇌관 및 마커는 미생물의 특정 하위 집합을 대상으로 선택적으로 선택 했다. 세균성 지역 사회 구성 평가 연속 하나 이상의 세균의 16S rRNA 유전자2,3의 하이퍼 지역 일반적으로 수행 됩니다. 이 연구에서 설명 하는 기반 하는 amplicon 시퀀싱 프로토콜 NGS 플랫폼에 대 한 충분 한 다양성을 제공 하는 동안 세균 taxa의 넓은 확대를 위한 수 있는 세균의 16S rRNA 유전자의 그 대상 500 bp V3-V4 지역 개발 다른 taxa 사이 구별. 또한,이 프로토콜을 쉽게 다른 뇌관 집합, 버섯의 ITS2 마커 나 진핵생물의 18S rRNA 소 단위를 대상으로 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.
다른 접근 같은 샷건 metagenomics, metatranscriptomics, 및 단일 셀 시퀀싱, 이점이 다른 해결된 미생물 게놈 및 커뮤니티 기능의 더 직접적인 측정을 포함 하 여, 이러한 기술은 일반적으로 더는 비싸고 계통 발생 프로 파일링 보다 계산 집중4여기 설명합니다. 또한, 루트 샘플에 샷건 metagenomics 및 metatranscriptomics을 수행 호스트 식물 게놈에 속하는 읽기의 큰 비율 수 있고이 한계를 극복 하는 방법을 여전히 개발된5,6되 고 있습니다.
어떤 실험 플랫폼와 마찬가지로 amplicon 기반 프로 파일링 하는 것은 실험적인 디자인 및 데이터 분석 하는 동안 고려 되어야 하는 잠재적인 편견의 수를 발생할 수 있습니다. 샘플 수집, DNA 추출, PCR 뇌관의 선택 및 라이브러리 준비를 수행 하는 방법을 방법을 포함 됩니다. 다른 방법을 생성 하 고, 사용 가능한 데이터의 양을 크게 영향을 미칠 수 고 또한 연구 사이 결과 비교 하는 노력을 방해 수 있습니다. 예를 들어 rhizosphere 박테리아7 와 다른 추출 기술의 사용 또는 DNA 추출 키트8,9 의 선택 제거 하는 방법 표시 되었습니다 크게 영향을 다운스트림 분석에 이르게 이 관한 미생물은 현재와 그들의 상대 나타났는데 되는 다른 결론 프로 파일링 amplicon 기반 사용자 지정할 수 있습니다, 이후 연구에서 비교를 만드는 전하실 수 있습니다. 지구 Microbiome 프로젝트 공장 관련 미생물 같은 복잡 한 시스템을 공부 하는 연구자의 응용 프로그램에 의해 발생 하는 변화를 최소화 하는 수단으로 표준화 된 프로토콜의 개발에서 도움이 될 것 이라고 제안 했다 연구10,11사이 다른 방법. 여기, 우리가 위의 주제의 대부분을 토론 하 고 어디 유용한 제안을 제공 적절 한.
프로토콜 색 사탕수수 에서 추출 DNA 기초가 DNA 분리 키트11를 사용 하 여 수집, rhizosphere, 토양과 루트 샘플 과정을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 세균성 지역 사회12,,1314의 구조를 결정 하는 일반적으로 이용한 NGS 플랫폼을 사용 하 여 자세한 amplicon 시퀀싱 워크플로 포함 합니다. 이 프로토콜 식물 뿌리, rhizosphere, 및 사탕수수 색, 지 시 메이 스, 그리고 Triticum aestivum15를 포함 하 여 18 monocot 종의 관련 된 토양의 최근 출판된 연구에 호스트의 넓은 범위에서 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 메서드는 또한 검증 된 다른 마커 유전자와 함께 사용 하기 위해 agave 미생물16,17 및 딸기 미생물 의 연구에 곰 팡이 ITS2 마커 유전자를 공부 하 고 그것의 성공적인 응용 프로그램에서와 같이 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 루트 endosphere, rhizosphere, 및 샘플 처리 및 다운스트림 시퀀싱 필드 샘플링에서 토양 미생물 지역 사회 구성에 대 한 설립된 파이프라인을 보여 줍니다. 공부 루트 관련 microbiomes 선물 독특한 도전, 인해 일부 샘플링에서 고유한 어려움에 토양에서. 토양은 매우 변수 육체 및 화학 재산의 점에서 그리고 다른 토양 조건 만큼 약간 몇 밀리미터28,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 농 무부-ARS (CRI 2030-21430-008-00D)에 의해 투자 되었다. TS는 NSF 대학원 연구 친교 프로그램에 의해 지원 됩니다.
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
