Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama
Summary
Burada, toprak, rizosferde ve kök endosphere microbiomes amplicon sıra verileri elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu bilgiler kompozisyon ve çeşitlilik bitki ilişkili mikrobiyal toplulukların araştırmak için kullanılan ve bitki türlerinin geniş bir kullanım için uygundur.
Abstract
Bitki ana bilgisayar ile ilişkili mikroorganizmalar arasında samimi etkileşim bitki fitness belirlemede önemlidir ve geliştirilmiş dayanıklılık abiyotik gerilmeler ve hastalıklar için teşvik edebilirsiniz. Bitki microbiome olabilir gibi son derece karmaşık, düşük maliyetli, yüksek üretilen iş amplicon tabanlı sıralama 16S rRNA gen gibi sık sık onun mikrobiyal kompozisyon ve çeşitlilik karakterize için tercih edilen yöntemlerdir. Ancak, bu tür deneyler zaman uygun metodoloji yelpazesi analizi ve örnekleri ve çalışmaları arasında karşılaştırmalar zorlaştırabilir önyargıları azaltmak için önemlidir. Bu iletişim kuralı, toplama ve DNA ekstraksiyon toprak, rizosferde ve kök örnekleri için standart bir metodoloji ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Buna ek olarak, biz Bu örneklerdeki bakteri toplulukları bileşimi keşfi için izin veren bir iyi kurulmuş 16S rRNA amplicon sıralama boru hattı vurgulayın ve kolayca diğer marker gen için adapte edilebilir. Bu boru hattı bitki türleri, sorgum, Mısır, buğday, çilek ve agav, dahil olmak üzere çeşitli için doğrulandı ve bitki organelleri kirlenme ile ilgili sorunların üstesinden yardımcı olabilir.
Introduction
Microbiomes bitki ilişkili dinamik ve karmaşık mikrobiyal topluluklar bakteri, arkeler, virüsler, mantarlar ve diğer ökaryotik mikroorganizmaların oluşur. Bitki hastalık neden onların iyi okudu rol yanı sıra, bitki ilişkili mikroplar da olumlu bitki sağlığı biyotik ve abiyotik stres tolerans iyileştirilmesi, besin kullanılabilirliği teşvik ve bitki büyüme yoluyla artırılması etkileyebilir etki üretimi. Bu nedenle, özellikle bitki kök endospheres, rhizospheres ve çevresindeki toprak ile ilişkilendirmek takson karakterize bulunmaktadır. Bazı mikroplar izolasyon laboratuvar oluşturulan medya kültürlü olabilir, birçok kısmen diğer mikroplar ile simbiyotik ilişkiler üzerine güveniyor olabilir çünkü çok yavaş büyümek değil veya bir laboratuar ortamında yinelenemez koşulları gerektirir. Serisi tabanlı filogenetik çevre ve ana bilgisayar ilişkili mikrobiyal örnekleri profil oluşturma ekimi ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve nispeten ucuz ve yüksek üretilen iş çünkü, mikrobiyal topluluk raporlaması için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir kompozisyon.
Yeni nesil (NGS) platformları1 sıralama çeşitli tarafından sağlanan uygun sıralama teknolojileri seçimi önemli faktörler de dahil olmak üzere kullanıcıların gereksinimlerini üzerinde bağlıdır: istediğiniz kapsamı, amplicon uzunluğu, beklenen toplum çeşitlilik, hem de hata oranı, okuma-uzunluk ve maliyet-başına-Çalıştır/megabase sıralama. Amplicon tabanlı sıralama deneylerinde dikkate alınması gereken başka bir ne gen AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır ve ne astar kullanılacak olan değişkendir. Tasarlarken veya astar seçimi yaparken, araştırmacılar genellikle bileşimleri amplifikasyon evrensellik ve taksonomik çözünürlük arasında ortaya çıkan amplicons üzerinden ulaşılabilir yapmak zorunda kalıyor. Bu nedenle, bu tür çalışmalar kez astar ve seçmeli olarak microbiome belirli alt kümeleri hedef işaretleyiciler açmadı. Bakteriyel topluluklar kompozisyonu değerlendirmek genellikle bir veya daha fazla bakteri 16S rRNA gen2,3hypervariable bölgelerin sıralama tarafından gerçekleştirilir. Bu çalışmada, biz dayalı bir amplicon tarif sıralama iletişim kuralı bu hedefleri 500 bp V3 V4 bölge için yeterli değişkenlik de sağlarken geniş amplifikasyon bakteriyel özellikleri sağlar bakteriyel 16S rRNA gen NGS platformu için geliştirilen farklı özellikleri arasında ayrım. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca diğer astar kümelerini, mantar ITS2 işaretçisi veya Ökaryotlar 18S rRNA altbirim hedefleme ile kullanmak için adapte edilebilir.
Av tüfeği metagenomics, metatranscriptomics ve tek hücreli sıralama, çözümlenmiş mikrobiyal genleri ve topluluk işlevi daha doğrudan ölçümü de dahil olmak üzere diğer avantajlar sunuyor gibi diğer yaklaşımlar, bu tekniklerin genellikle daha fazla iken Burada açıklanan4pahalı ve filogenetik profil oluşturma daha yoğun hesaplama. Ayrıca, performans üzerinde kök örnekleri av tüfeği metagenomics ve metatranscriptomics okuma için ana bitki genom ait büyük bir yüzdesi görüntüler ve bu sınırlamayı aşmak için yöntemleri hala gelişmiş5,6davranıyorsun.
Herhangi bir deneysel platformunda olduğu gibi amplicon tabanlı profil oluşturma deneysel tasarım ve veri çözümleme sırasında dikkate alınması gereken potansiyel önyargıları bir dizi neden olabilir. Bu örnek koleksiyonu, DNA ekstraksiyon, PCR astar yelpazesi ve Kütüphane hazırlık nasıl gerçekleştirildiğini yöntemleri içerir. Farklı yöntem oluşturulan kullanılabilir veri miktarını önemli ölçüde etkileyebilir ve ayrıca çabaları çalışmalar arasında karşılaştırılması için engel olabilir. Örneğin, rizosferde bakteri7 ve farklı çıkarma teknikleri veya seçim DNA ekstraksiyon kitleri8,9 kaldırma yöntemi gösterilmiştir aşağı akım analizi, yol açan önemli ölçüde etkisi farklı sonuçlar ile ilgili mikroplar hediye ve onların göreceli zenginliği olan. Amplicon tabanlı profil oluşturma özelleştirilmiş beri çalışmalar arasında karşılaştırmalar yapmak zor olabilir. Earth Microbiome projesi bitki ilişkili microbiome gibi karmaşık sistemleri eğitim araştırmacılar standart protokoller geliştirme uygulama tarafından neden olduğu değişkenlik en aza indirme aracı olarak yararlanacak önerdi farklı yöntemleri arasında çalışmalar10,11. Burada, biz Yukarıdaki konuların pek çok tartışmak ve en iyi uygulamalar olarak nereye teklif öneriler uygun.
Protokol sorgum bicolor ve köklü bir DNA izolasyon kit11kullanarak açılan DNA toplama toprak, rizosferde ve kök örnekleri sürecini gösterir. Ayrıca, bizim iletişim kuralı bir detaylı amplicon sıralama iş akışı, bakteriyel topluluklar12,13,14yapısını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir NGS platformu kullanarak içerir. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere çok çeşitli bitki kökleri, rizosferde ve ilişkili-toprak sorgum bicolor, Zea mays ve Triticum soğanı15de dahil olmak üzere 18 monocot tür yayınlanan bir çalışmada konaklarda doğrulandı. Bu yöntem aynı zamanda diğer marker gen kullanılmak üzere mantar ITS2 marker gen çalışmaları agav microbiome16,17 ve çilek microbiome eğitim için başarılı uygulama tarafından gösterildiği gibi doğrulandı 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı kök endosphere, rizosferde ve toprak mikrobiyal topluluk kompozisyonlar, örnek işleme ve aşağı akım sıralama alanı örnekleme keşfetmek için kurulan bir boru hattı gösterir. Eğitim microbiomes kök ilişkili benzersiz sorunlar, kusura bakma ama kısmen örnekleme doğal zorluklar için topraktan sunar. Toprak son derece değişken fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından vardır ve farklı toprak koşullarına kadar az birkaç milimetre28,<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D) tarafından finanse edildi. TS NSF yüksek lisans araştırma bursu programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
