Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere
Summary
Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.
Abstract
De intieme interactie tussen plant host en geassocieerde micro-organismen is cruciaal bij het bepalen van de geschiktheid van de plant, en verbeterde tolerantie voor abiotische stress en ziekten kan stimuleren. Als de plant microbiome zeer complexe, goedkope kunnen, zijn high-throughput methoden zoals amplicon gebaseerde sequentiebepaling van het 16S rRNA gen vaak voorkeur voor het karakteriseren van de microbiële samenstelling en diversiteit. De selectie van geschikte methode bij het uitvoeren van dergelijke experimenten is echter cruciaal voor vermindering van de vooroordelen die analyse en vergelijking tussen monsters en studies moeilijk kunnen maken. Dit protocol beschrijft in detail een gestandaardiseerde methode voor het verzamelen en de extractie van DNA van bodem, rhizosfeer en wortel monsters. Bovendien, we markeren een gevestigde 16S rRNA amplicon sequencing pijpleiding, waarmee voor de verkenning van de samenstelling van bacteriële gemeenschappen in deze monsters, en kan gemakkelijk worden aangepast voor andere markers. Deze pijpleiding is gevalideerd voor allerlei soorten van planten, met inbegrip van sorghum, maïs, tarwe, aardbei en agave, en kan helpen bij het overwinnen van kwesties in verband met de besmetting van plant organellen.
Introduction
Plant-geassocieerde microbiomes bestaan van dynamische en complexe microbiële gemeenschappen bestaat uit bacteriën, archaea, virussen, schimmels en andere eukaryote micro-organismen. Naast hun goed bestudeerde rol bij het ontstaan van plantenziekten, kunnen plant-geassocieerde microben ook positief beïnvloeden gezondheid van planten door verbetering van tolerantie-doorbraak tot biotische en abiotische stress, bevordering van de beschikbaarheid van nutriënten en verbetering van de groei van de planten door middel van de productie van fytohormonen. Om deze reden bestaat bijzondere belangstelling in het karakteriseren van de taxa die met plant wortel endospheres, rhizospheres en de omliggende grond associëren. Terwijl sommige microben gekweekt in isolatie op laboratorium gegenereerde media worden kunnen, kunnen niet, velen voor een deel omdat ze op symbiotische relaties met andere microben vertrouwen kunnen, zeer langzaam groeien of verplichten de voorwaarden die niet kunnen worden gerepliceerd in een testomgeving. Omdat het de noodzaak voor teelt omzeilt en relatief goedkoop en high-throughput is, reeks gebaseerde fylogenetische profilering van milieu- en host-geassocieerde microbiële monsters geworden een methode voor het analyseren van de microbiële Gemeenschap voorkeur samenstelling.
De selectie van geschikte sequencing technologieën geboden door diverse volgende generatie sequencing (NGS) platformen1 is afhankelijk van de behoeften van de gebruikers, met belangrijke factoren waaronder: gewenste dekking, amplicon lengte, verwacht Gemeenschap diversiteit, evenals sequencing foutenpercentage, lees-lengte, en de kosten-per-run/megabase. Een andere variabele die moet worden beschouwd in amplicon gebaseerde sequencing experimenten is wat gen zal worden versterkt en wat inleidingen worden gebruikt. Bij het ontwerpen of kiezen inleidingen, worden onderzoekers vaak gedwongen om compromissen tussen de universaliteit van de versterking en de taxonomische resolutie haalbare uit de resulterende waarbij. Om deze reden koos deze soorten studies vaak inleidingen en markeringen die selectief gericht zijn op specifieke deelverzamelingen van de microbiome. Evaluatie van de samenstelling van bacteriële Gemeenschappen wordt vaak bereikt door sequentiebepaling één of meer van de hypervariable regio’s van de bacteriële 16S rRNA gen2,3. In deze studie, beschrijven we een amplicon gebaseerd sequencing protocol ontwikkeld voor een NGS-platform dat doelstellingen de 500 bp V3-V4-regio van de bacteriële 16S rRNA gen, waarmee een brede versterking van bacteriële taxa terwijl ook het verstrekken van voldoende variabiliteit te onderscheid maken tussen verschillende taxa. Bovendien, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik met andere primer sets, zoals degenen die de ITS2 markering van schimmels of de 18S rRNA subeenheid van eukaryoten targeten.
Terwijl andere benaderingen zoals shotgun metagenomics, metatranscriptomics en eencellige sequencing, bieden andere voordelen, waaronder opgelost microbiële genomen en meer directe meting van de functie van de Gemeenschap, zijn deze technieken meestal meer duur en computationeel intensief dan de fylogenetische profilering hier4 beschreven. Bovendien, een groot percentage van leest die behoren tot het genoom van de plant host uitvoeren van shotgun metagenomics en metatranscriptomics op wortel monsters opbrengsten, en methoden om deze beperking ondervangen worden nog steeds ontwikkelde5,6.
Net als bij een experimenteel platform, kan amplicon gebaseerde profiling leiden tot een aantal potentiële vooroordelen die moeten worden onderzocht tijdens de experimentele design en data-analyse. Het gaat hierbij om de methoden van sample collectie, DNA extractie, selectie van PCR inleidingen en hoe de voorbereiding van de bibliotheek wordt uitgevoerd. Verschillende methoden kunnen beduidend beïnvloeden de hoeveelheid bruikbare gegevens gegenereerd, en kunnen ook een belemmering vormen voor de inspanningen om resultaten tussen studies te vergelijken. Bijvoorbeeld, de methode van het verwijderen van de rhizosfeer bacteriën7 en het gebruik van verschillende extractie technieken of keuze van DNA extractie kits8,9 is aangetoond dat ze beduidend beïnvloeden downstream analyse, die leidt tot verschillende conclusies met betrekking tot die microben heden en hun relatieve abundanties zijn. Aangezien amplicon gebaseerde profielen kan worden aangepast, kan waardoor vergelijkingen over studies worden uitdagende. De aarde Microbiome Project heeft voorgesteld dat de onderzoekers bestuderen van complexe systemen, zoals de plant-geassocieerde microbiome van de ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen als een middel profiteren zou voor het minimaliseren van de variabiliteit veroorzaakt door de toepassing van verschillende methoden tussen studies10,11. Hier bespreken we veel van de bovengenoemde onderwerpen en bieden suggesties over beste praktijken waar nodig.
Het protocol toont het proces van verzamelen bodem, rhizosfeer en wortel monsters van Sorghum bicolor en uitgepakt DNA met een gevestigde DNA isolatie kit11. Daarnaast is ons protocol bevat een gedetailleerde amplicon sequencing workflow, met behulp van een algemeen gebruikte NGS-platform, om te bepalen van de structuur van de bacteriële gemeenschappen12,13,14. Dit protocol is gevalideerd voor het gebruik in een brede waaier van plant hosts in een recent gepubliceerde studie van de wortels, rhizosfeer en bijbehorende-bodems van 18 monocot-soorten, met inbegrip van Sorghum bicolor, Zea mays, en Triticum aestivum15. Deze methode is ook gevalideerd voor gebruik met andere markers, zoals blijkt uit de succesvolle toepassing aan het bestuderen van de schimmel ITS2 marker-gen in studies van de agave microbiome16,17 en aardbei microbiome 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol toont een gevestigde pijpleiding voor het verkennen van de wortel endosphere, rhizosfeer en bodem microbiële Gemeenschap composities, uit veld bemonstering monster verwerking en downstream sequencing. Studeren wortel-geassocieerde microbiomes presenteert unieke uitdagingen, wijten gedeeltelijk de inherente moeilijkheden bij steekproeven uit bodem. Bodems zijn zeer variabel in termen van fysische en chemische eigenschappen en verschillende bodemgesteldheid kunnen worden gescheiden door zo weinig als een paar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS wordt ondersteund door de NSF Graduate Research Fellowship Program.
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
