Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l’uso con una vasta gamma di specie di piante.
Abstract
L’intima interazione tra pianta ospite e microrganismi associati è cruciale nel determinare la pianta fitness e può favorire una migliore tolleranza agli stress abiotici e malattie. Come il microbioma di pianta può essere molto complesso, a basso costo, metodi di high throughput come amplicon di sequenziamento del gene del rRNA 16S sono spesso preferiti per caratterizzare la composizione microbica e la diversità. Tuttavia, la selezione di una metodologia appropriata quando lo svolgimento di tali esperimenti è fondamentale per ridurre le distorsioni che possono rendere difficile analisi e confronti tra campioni e studi. Questo protocollo descrive in dettaglio una metodologia standardizzata per la raccolta e l’estrazione di DNA da terreno, rizosfera ed esempi di radice. Inoltre, evidenziamo una pipeline di sequenziamento consolidata 16S rRNA amplicone che consente per l’esplorazione della composizione delle comunità batteriche in questi campioni e può essere facilmente adattati per altri geni marcatori. Questa pipeline è stata convalidata per una varietà di specie vegetali, tra cui sorgo, mais, frumento, fragola e agave e può aiutare a superare i problemi associati alla contaminazione da organelli di pianta.
Introduction
Microbiomi pianta-collegato è costituito da comunità microbiche dinamica e complessa, costituita da batteri, archaea, virus, funghi e altri microrganismi eucarioti. Oltre al loro ruolo ben studiata a causa di malattia delle piante, microbi pianta-collegato possono influenzare positivamente anche pianta salute migliorando la tolleranza agli stress biotici e abiotici, promuovendo la disponibilità di nutrienti, e migliorare la crescita delle piante attraverso la produzione di ormoni vegetali. Per questo motivo, particolare interesse esiste nel caratterizzare i taxa che associano con pianta radice endospheres, metodologie e il terreno circostante. Mentre alcuni microbi possono essere coltivate in isolamento il laboratorio multimediale generato, molti non possono, in parte perché essi possono si basano su relazioni simbiotiche con altri microbi, crescono molto lentamente, o richiedono condizioni che non possono essere replicate in un ambiente di laboratorio. Perché aggira la necessità per la coltivazione ed è relativamente poco costoso e ad alta velocità, analisi filogenetica basata su sequenza di campioni microbici ambientali e host-associato è diventata un metodo comodo per analizzante comunità microbica composizione.
La selezione delle tecnologie di sequenziamento appropriati forniti da vari prossima generazione sequenziamento (NGS) piattaforme1 dipende dalla necessità degli utenti, con importanti fattori tra cui: copertura desiderata, lunghezza amplicon, previsto comunità diversità, come pure sequenziamento tasso di errore, la lettura-lunghezza e il costo-per-Esegui/megabase. Un’altra variabile che deve essere considerato in esperimenti di sequenziamento degli ampliconi è quale gene sarà amplificati e verrà utilizzato quale primer. Quando si progetta o scegliendo gli iniettori, i ricercatori spesso sono costretti a fare compromessi tra l’universalità dell’amplificazione e la risoluzione tassonomica ottenibile dagli ampliconi risultanti. Per questo motivo, questi tipi di studi scelto spesso primer e marcatori che mirare selettivamente specifici sottoinsiemi del microbioma. Valutare la composizione delle comunità batteriche avviene comunemente ordinando uno o più delle regioni ipervariabili del batterici 16S rRNA gene2,3. In questo studio, descriviamo un amplicone basato sequenziamento protocollo sviluppato per una piattaforma NGS quella regione di bp V3-V4 obiettivi la 500 del gene del rRNA 16S batterica, che consente ampia amplificazione dei taxa batterici, fornendo inoltre una sufficiente variabilità a distinguere tra diversi taxa. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente adattato per l’uso con altri set di primer, come quelli targeting il marcatore ITS2 di funghi o la subunità di rRNA 18S degli eucarioti.
Mentre altri approcci come fucile metagenomica, metatranscriptomics e sequenziamento unicellulare, offrono altri vantaggi tra cui risolti genomi microbici e misura più diretta della funzione di comunità, queste tecniche sono in genere più costoso e computazionalmente intensivi rispetto del profilo filogenetico descritto qui4. Inoltre, eseguendo il fucile metagenomica e metatranscriptomics su campioni di radice produce una grande percentuale di letture appartenendo a genoma della pianta ospite e metodi per superare questa limitazione sono ancora in fase sviluppato5,6.
Come con qualsiasi piattaforma sperimentale, profiling basato su amplicone può introdurre un numero di potenziali pregiudizi che dovrebbe essere considerato durante l’analisi di dati di progettazione e sperimentale. Questi includono i metodi di raccolta dei campioni, DNA estrazione, selezione degli iniettori di PCR e come preparazione di libreria viene eseguita. Diversi metodi possono influenzare notevolmente la quantità di dati utilizzabili generati e possono anche ostacolare gli sforzi per confrontare i risultati tra gli studi. Ad esempio, il metodo di rimozione rizosfera batteri7 e l’uso di tecniche di estrazione diversa o scelta di DNA estrazione Kit8,9 sono stati indicati per avere un impatto significativo dell’analisi a valle, che conduce a conclusioni differenti per quanto riguarda cui i microbi sono presenti e loro abbondanza relativa. Poiché profiling basato su amplicone può essere personalizzato, fare paragoni tra gli studi può essere impegnativo. Il progetto microbioma terra ha suggerito che i ricercatori che studiano i sistemi complessi come il microbioma pianta-collegato trarrebbero beneficio dallo sviluppo di protocolli standardizzati come mezzo per ridurre al minimo la variabilità causata dall’applicazione di metodi differenti tra studi10,11. Qui, discutiamo molti degli argomenti di cui sopra e offrire suggerimenti per quanto riguarda le migliori pratiche dove opportuno.
Il protocollo viene illustrato il processo di raccolta del suolo, rizosfera ed esempi di radice da sorgo bicolore ed estrazione DNA usando una consolidata kit di isolamento del DNA11. Inoltre, il nostro protocollo include un flusso di lavoro sequenziamento degli ampliconi dettagliate, utilizzando una piattaforma NGS comunemente utilizzata, per determinare la struttura delle comunità batteriche12,13,14. Questo protocollo è stato convalidato per l’uso in una vasta gamma di ospiti della pianta in un recente studio pubblicato di radici, rizosfera e associati-terreni di 18 specie di monocot compreso Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Questo metodo è stato convalidato anche per l’utilizzo con altri geni marcatori, come dimostrato dalla sua riuscita applicazione allo studio del gene marcatore ITS2 fungo negli studi del agave microbiome16,17 e fragola microbiome 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo dimostra una pipeline stabilita per esplorare radice endosphere, rizosfera e composizioni di comunità microbica del suolo, dalla campionatura del campo di trattamento del campione e sequenziamento a valle. Studio associato radice microbiomi presenta sfide uniche, dovuto in parte per le difficoltà insite nel campionamento dal suolo. I terreni sono altamente variabile in termini di proprietà fisiche e chimiche, e condizioni del terreno possono essere separate da appena pochi millimetri<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS è supportato dal NSF Graduate Research Fellowship Program.
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
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