Summary

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

Published: May 02, 2018
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Summary

ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス データを取得するためのプロトコルについて述べる。この情報は、組成やプラント関連の微生物群集の多様性を調査するため、植物種の広い範囲での使用に適しています。

Abstract

植物宿主と病原性菌の親密な相互作用は植物の適応度を決定する上で重要な非生物的ストレスや病気に対する耐性を改善を促進することができます。工場マイクロバイは、非常に複雑な低コストにすることができます、私アンプリコン ベース 16S rRNA 遺伝子の塩基配列決定など高スループット方法が多いその微生物の組成と多様性を特徴付けるため。しかし、そのような実験を行う際の適切な方法の選択は、難しい分析とサンプルと研究間の比較を行うことができますバイアスを減らすため重要です。このプロトコルは、コレクション、土壌、根圏、およびルート サンプルからの DNA の抽出のための標準化された方法論を詳しく説明します。さらに、我々 はこれらのサンプルの細菌群集組成の調査は、確立された 16S rRNA 増幅シーケンス パイプラインを強調表示し、他のマーカー遺伝子のため簡単に適応することができます。このパイプラインは、ソルガム、トウモロコシ、小麦、イチゴ、アガベを含む植物種の様々 な検証されている、植物細胞小器官からの汚染に関連する問題を克服するを助けることができます。

Introduction

プラント関連内細菌叢解析は細菌、古細菌、ウイルス、菌類および他の真核微生物から成る動的で複雑な微生物群集から成っています。よく研究植物の病気の原因ではなく、植物共生微生物できますも積極的に影響を与える植物の健康によって生物的・非生物的ストレス耐性の向上、栄養アベイラビリティを推進・強化による植物の成長植物ホルモンの生産。このため、特定の関心は植物根 endospheres、根圏、周辺土壌と関連付ける分類群を特徴付けるに存在します。一方、いくつかの微生物は、生成されたメディアを研究室で分離培養することができます、多くはできない、他の微生物と共生関係に依存している場合がありますので、一部非常にゆっくり育つまたはラボ環境では再現できない条件を必要とします。栽培の必要性を回避できますので、比較的安価な高スループット シーケンスを用いた系統プロファイリング環境とホスト関連付けられている微生物サンプルの微生物群集を試金するため最寄り方法となっています。組成物。

次世代シークエンシング (NGS) のプラットフォーム1各種によって提供される適切なシーケンス テクノロジーの選択は、重要な要因を含むユーザーのニーズに依存して: 必要なカバレッジ、私アンプリコン長さ予想コミュニティ多様性と同様、誤り率、読み取りの長さ、および、コスト-あたり-実行/megabase のシーケンスします。私アンプリコン ベースのシーケンス実験で考慮する必要があるもう一つの変数がどのような遺伝子が増幅され、どのようなプライマーが使用されます。設計またはプライマーを選択するとき、研究者は結果の産物から達成可能な増幅の普遍性と分類学的解像度のトレードオフを作るを強いられる。このため、研究のこれらのタイプは、しばしばプライマーと、マイクロバイの特定のサブセットを選択的にターゲット マーカーを選んだ。細菌群集組成の評価は一般的に細菌の 16S rRNA 遺伝子2,3の超可変領域の 1 つ以上のシーケンスで実行します。本研究では、私アンプリコン ベースについて述べるシーケンス プロトコルはそのターゲット、500 bp V3 V4 の領域に十分な可変性を提供しながら細菌種の広範な増幅を可能にする細菌の 16S rRNA 遺伝子の NGS プラットフォーム用に開発。異なる分類群の間を区別します。さらに、このプロトコルは簡単に他のプライマー セットなどの菌類の ITS2 マーカーや真核生物の 18S rRNA サブユニットをターゲットで使用するために適応できます。

他に近づくような散弾銃メタゲノム、メタトランスクリプトミクス、および単一セルの配列を提供する解決の微生物ゲノムとコミュニティ機能のより直接測定を含む他の利点と、これらの技術が通常より多く高価で、ここで説明した系統プロファイリング4よりも計算量の多い。また、宿主植物ゲノムに属する読み取りの大部分をもたらすルート サンプルに散弾銃メタゲノムおよびメタトランスクリプトミクスを実行して、この制限を克服する方法はまだ開発5,6をされています。

実験プラットフォームでも私アンプリコン ベースのプロファイリングは、実験デザインとデータ解析時に考慮すべき潜在的なバイアスの数を導入できます。検体の採取、DNA 抽出、PCR のプライマーの選択およびライブラリの準備を実行する方法のメソッドが含まれます。さまざまな方法は、生成されると、使用可能なデータの量に大きく影響することができますや、また研究間で結果を比較するための努力を妨げることができます。たとえば、根圏細菌7と異なる抽出技術の使用または DNA 抽出キット8,9の選択を除去する方法につながる下流解析に大きく影響する示されています。異なる結論に関して、微生物が存在し、彼らの相対的な存在量。私アンプリコン ベースのプロファイリングをカスタマイズすることができます、ので研究間で比較することが挑戦することができます。地球マイクロバイ プロジェクトのアプリケーションによって引き起こされる変動を最小限に抑える手段として標準化されたプロトコルの開発からプラント関連マイクロバイなど複雑なシステムを調査している研究が恩恵を示唆しています。研究10,11の間さまざまな方法。ここでは、我々 は上記のトピックの多くについて説明し、場所をベスト プラクティスとして提供提案が適切な。

プロトコルは、ソルガム確立された DNA 分離キット11を使用して抽出 DNA からの収集土、根、およびルート サンプル処理を示します。さらに、我々 のプロトコルには、細菌群集12,13,14の構造を決定する一般的利用 NGS プラットフォームを使用して詳細な私アンプリコン シーケンス ワークフローが含まれています。このプロトコルは、根、根、ソルガム、トウモロコシ、およびコムギ15を含む 18 の単子葉種の関連付けられている土壌の最近出版された調査で植物のホストの広い範囲で使用するために検証されています。このメソッドが他のマーカー遺伝子を使用も検証されたリュウゼツラン マイクロバイ16,17いちごマイクロバイに関する研究真菌 ITS2 マーカー遺伝子を勉強への適用によって示されるように18

Protocol

1. 収集とルート Endosphere、根、土壌試料の分離 滅菌オートクレーブ純水 (サンプルあたりの水の少なくとも 90 mL) フィールドを入力する前に。着生植物の除去バッファー (サンプルあたり少なくとも 25 mL) を準備するには、1 L の滅菌水に KH2PO4の 6.75 g、K2HPO4、8.75 g およびトリトン X-100 の 1 mL を追加します。0.2 μ m の細孔径を持つ真空フィルターを使用し…

Representative Results

推奨されるプロトコルを実行する必要があります結果、データセットの各サンプルに戻る一致し、いずれか細菌に代入することができますインデックス付きのペアエンド リードの操作分類単位 (乙) または順序の変形 (ESV、増幅とも呼ばれますシーケンス バリアント (ASV) と sub-operational 分類単位 (sOTU)) は、下流の分析によって異なります。高品質シーケンス データを?…

Discussion

このプロトコルは、ルート endosphere、根、およびサンプル処理し、下流配列にサンプリング、フィールドからの土壌微生物群集組成の基礎の確立されたパイプラインを示します。勉強ルート関連内細菌叢解析特有の課題、ため一部サンプリングの固有の難しさへの土壌から。土壌は非常に物理的・化学的性質の面で変数と異なる土壌条件はわずか数ミリ28,<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、米国農務省アルス (CRIS 2030-21430-008-00D) によって賄われていた。TS は、NSF 大学院研究フェローシップ ・ プログラムによってサポートされます。

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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Cite This Article
Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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