Summary

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

Published: May 02, 2018
doi:

Summary

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

Abstract

공장 호스트와 관련 된 미생물의 친밀 한 상호작용 공장 피트 니스, 결정에 중요 한 이며 abiotic 스트레스와 질병을 향상 된 공차를 육성 하실 수 있습니다. 매우 복잡 한, 낮은-비용 식물 미생물 수, 16S rRNA 유전자의 amplicon 기반 시퀀싱 등 높은 처리량 방법의 미생물 조성과 다양성 특성화에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 이러한 실험을 실시 하는 경우 적절 한 방법론의 선택이 어려운 분석 및 샘플 연구 사이의 비교를 만들 수 있는 편견을 감소 시키기를 위해 중요 합니다. 이 프로토콜 수집 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플에서 DNA 추출에 대 한 표준화 된 방법론을 세부 사항에 설명합니다. 또한, 우리이 샘플에서 세균성 지역 사회 구성의 탐사를 허용 하는 기초가 튼튼한 16S rRNA amplicon 시퀀싱 파이프라인을 선택 하 고 다른 마커 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 파이프라인 식물 종, 사탕수수, 옥수수, 밀, 딸기, 그리고 용 설 란, 등의 다양 한 검증 되었습니다 그리고 식물 세포에서 오염과 관련 된 문제를 극복 하는 것을 도울 수 있다.

Introduction

역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼1 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 따라 포함 하는 중요 한 요소: 원하는 범위, amplicon 길이, 예상 커뮤니티 다양성, 뿐만 아니라 오류 속도, 읽기-길이, 그리고는 비용-당-실행/megabase 시퀀싱. Amplicon 기반 시퀀싱 실험에서 고려 되어야 또 다른 변수 어떤 유전자 증폭 될 것 이며 어떤 뇌관을 사용 됩니다. 때 설계 또는 뇌관을 선택, 연구 결과 amplicons에서 달성 증폭의 보편성과 분류학 해상도 간의 절충이 종종 밖에 없습니다. 이러한 이유로 이러한 유형의 연구는 자주 뇌관 및 마커는 미생물의 특정 하위 집합을 대상으로 선택적으로 선택 했다. 세균성 지역 사회 구성 평가 연속 하나 이상의 세균의 16S rRNA 유전자2,3의 하이퍼 지역 일반적으로 수행 됩니다. 이 연구에서 설명 하는 기반 하는 amplicon 시퀀싱 프로토콜 NGS 플랫폼에 대 한 충분 한 다양성을 제공 하는 동안 세균 taxa의 넓은 확대를 위한 수 있는 세균의 16S rRNA 유전자의 그 대상 500 bp V3-V4 지역 개발 다른 taxa 사이 구별. 또한,이 프로토콜을 쉽게 다른 뇌관 집합, 버섯의 ITS2 마커 나 진핵생물의 18S rRNA 소 단위를 대상으로 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.

다른 접근 같은 샷건 metagenomics, metatranscriptomics, 및 단일 셀 시퀀싱, 이점이 다른 해결된 미생물 게놈 및 커뮤니티 기능의 더 직접적인 측정을 포함 하 여, 이러한 기술은 일반적으로 더는 비싸고 계통 발생 프로 파일링 보다 계산 집중4여기 설명합니다. 또한, 루트 샘플에 샷건 metagenomics 및 metatranscriptomics을 수행 호스트 식물 게놈에 속하는 읽기의 큰 비율 수 있고이 한계를 극복 하는 방법을 여전히 개발된5,6되 고 있습니다.

어떤 실험 플랫폼와 마찬가지로 amplicon 기반 프로 파일링 하는 것은 실험적인 디자인 및 데이터 분석 하는 동안 고려 되어야 하는 잠재적인 편견의 수를 발생할 수 있습니다. 샘플 수집, DNA 추출, PCR 뇌관의 선택 및 라이브러리 준비를 수행 하는 방법을 방법을 포함 됩니다. 다른 방법을 생성 하 고, 사용 가능한 데이터의 양을 크게 영향을 미칠 수 고 또한 연구 사이 결과 비교 하는 노력을 방해 수 있습니다. 예를 들어 rhizosphere 박테리아7 와 다른 추출 기술의 사용 또는 DNA 추출 키트8,9 의 선택 제거 하는 방법 표시 되었습니다 크게 영향을 다운스트림 분석에 이르게 이 관한 미생물은 현재와 그들의 상대 나타났는데 되는 다른 결론 프로 파일링 amplicon 기반 사용자 지정할 수 있습니다, 이후 연구에서 비교를 만드는 전하실 수 있습니다. 지구 Microbiome 프로젝트 공장 관련 미생물 같은 복잡 한 시스템을 공부 하는 연구자의 응용 프로그램에 의해 발생 하는 변화를 최소화 하는 수단으로 표준화 된 프로토콜의 개발에서 도움이 될 것 이라고 제안 했다 연구10,11사이 다른 방법. 여기, 우리가 위의 주제의 대부분을 토론 하 고 어디 유용한 제안을 제공 적절 한.

프로토콜 색 사탕수수 에서 추출 DNA 기초가 DNA 분리 키트11를 사용 하 여 수집, rhizosphere, 토양과 루트 샘플 과정을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 세균성 지역 사회12,,1314의 구조를 결정 하는 일반적으로 이용한 NGS 플랫폼을 사용 하 여 자세한 amplicon 시퀀싱 워크플로 포함 합니다. 이 프로토콜 식물 뿌리, rhizosphere, 및 사탕수수 색, 지 시 메이 스, 그리고 Triticum aestivum15를 포함 하 여 18 monocot 종의 관련 된 토양의 최근 출판된 연구에 호스트의 넓은 범위에서 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 메서드는 또한 검증 된 다른 마커 유전자와 함께 사용 하기 위해 agave 미생물16,17 및 딸기 미생물 의 연구에 곰 팡이 ITS2 마커 유전자를 공부 하 고 그것의 성공적인 응용 프로그램에서와 같이 18.

Protocol

1. 수집 및 루트 Endosphere, Rhizosphere, 및 토양 샘플의 분리 이전에 소독을 필드, 압력솥 초순 (샘플 당 물 90 mL 이상)를 입력 합니다. KH2포46.75 g, 8.75 g의 K2HPO4, 살 균 물 1 l 트라이 톤 X-100의 1 mL를 추가 하 여 epiphyte 제거 버퍼 (샘플 당 적어도 25 mL)를 준비 합니다. 0.2 µ m 기 공 크기와 진공 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독. 1.2 ~ 1.5 단계, 모든 에탄올 소독 깨끗 …

Representative Results

일치 하는 각 샘플을 다시 하 고 어느 박테리아에 할당 될 수 있는 인덱싱된 쌍 간 읽기의 데이터 집합에서 발생 해야 권장된 프로토콜을 수행 조작 상 분류학 단위 (OTU) 또는 정확한 시퀀스 변종 (ESV, amplicon 라고도 시퀀스 변종 (ASV) 및 sub-operational 분류학 단위 (sOTU)), 다운스트림 분석에 따라. 높은-품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 해야 합니다 주의 샘플 간에 일관성을 유지 …

Discussion

이 프로토콜에서는 루트 endosphere, rhizosphere, 및 샘플 처리 및 다운스트림 시퀀싱 필드 샘플링에서 토양 미생물 지역 사회 구성에 대 한 설립된 파이프라인을 보여 줍니다. 공부 루트 관련 microbiomes 선물 독특한 도전, 인해 일부 샘플링에서 고유한 어려움에 토양에서. 토양은 매우 변수 육체 및 화학 재산의 점에서 그리고 다른 토양 조건 만큼 약간 몇 밀리미터28,<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 농 무부-ARS (CRI 2030-21430-008-00D)에 의해 투자 되었다. TS는 NSF 대학원 연구 친교 프로그램에 의해 지원 됩니다.

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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Cite This Article
Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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