Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere
Summary
Здесь мы описываем протокол для получения данных последовательности ампликон почвы, ризосфере и корня endosphere microbiomes. Эта информация может использоваться для изучения состава и разнообразие растений связанные микробных сообществ и подходит для использования с широким спектром видов растений.
Abstract
Интимные взаимодействие между растение хост и связанные микроорганизмов имеет решающее значение в определении фитнес завод и может способствовать повышение толерантности к абиотическим стрессам и болезням. Как завод микрофлора может быть весьма сложным, лоу кост, высок объём методы, такие как на основе ампликон секвенирование гена 16S рРНК часто являются предпочтительными для характеризующие его микробный состав и разнообразия. Однако выбор соответствующей методологии при проведении таких экспериментов имеет решающее значение для снижения отклонений, которые может затруднить анализ и сравнение образцов и исследования. Этот протокол описывает подробно стандартизированной методологии для сбора и извлечения ДНК из почвы, ризосфере и корень. Кроме того мы выделите устоявшихся 16S рРНК ампликон последовательности конвейера, который позволяет для изучения состава бактериальной общин в этих образцах и может быть легко адаптирована для других маркерных генов. Этот трубопровод был одобрен для различных видов растений, в том числе сорго, кукурузы, пшеницы, клубника и агавы и может помочь преодолеть проблемы, связанные с загрязнением от завода органеллы.
Introduction
Завод связанные microbiomes состоят из динамичных и сложных микробных сообществ, состоит из бактерий, археи, вирусов, грибков и других эукариотических микроорганизмов. Помимо их хорошо изучена роль в возникновении болезни растений связанных растений микробы могут также положительно повлиять здоровья растений, повышение толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым наличия питательных веществ и поощрения повышения роста растений через производство фитогормонов. По этой причине в характеристике таксонов, которые ассоциируются с завода корень endospheres, rhizospheres и окружающий грунт существует особый интерес. Хотя некоторые микробы могут быть культивировали в изоляции на лабораторных созданный СМИ, многие нельзя отчасти потому, что они могут полагаться на симбиотические отношения с другими микробами, растут очень медленно, или требуют условий, которые не могут быть реплицированы в лабораторной среде. Потому что он обходит необходимость культивирования и относительно недорогой и высокой пропускной способности, филогенетическое профилирование на основе последовательности экологических и связанных с ними принимающей микробиологических образцов стала предпочтительным методом для assaying микробных композиция.
Выбор соответствующей последовательности технологий, предоставляемые различными следующего поколения виртуализации платформ (НГС)1 зависит от потребностей пользователей, с важными факторами, в том числе: желаемого охвата, длина ампликонами, ожидается сообщества разнообразия, а также виртуализации-погрешность, чтение Длина и стоимости за запуск/megabase. Какие Джин будет усилен и какие праймеры будет использоваться другой переменной, которая должна рассматриваться в экспериментах на базе ампликон последовательности. При создании или выборе грунты, исследователи часто вынуждены компромисс между универсальностью амплификации и таксономические резолюции достижимые из результирующей ампликонами. По этой причине эти виды исследований часто выбрал грунты и маркеры, которые выборочно целевых конкретных подмножеств микрофлора. Оценке состава бактериальных сообществ обычно осуществляется путем sequencing один или более из гипервариабельных регионов бактериальных 16S рРНК ген2,3. В этом исследовании, мы описываем ампликон на основе последовательности протокол, разработанный для платформы NGS этого региона цели 500 bp V3 V4 бактериальных 16S рРНК ген, который позволяет для широкого амплификации обеспечивая при этом достаточно изменчивости для бактериальных таксонов различие между различными таксонов. Кроме того этот протокол может быть легко адаптирована для использования с другими наборами грунт, например маркер ITS2 грибов или 18S рРНК Субблок эукариот.
В то время как другие подходы, такие, как ружье метагеномики, metatranscriptomics и одноклеточного последовательности, предлагают другие преимущества, включая решена микробных геномов и более прямого измерения функции сообщества, эти методы обычно более дорого и вычислительных ресурсов, чем филогенетических профилирования описано здесь4. Кроме того выполняя метагеномики ружье и metatranscriptomics на образцах корень дает большой процент читает, принадлежащих к принимающей генома растений, и методы, чтобы преодолеть это ограничение, по-прежнему подвергаются развитых5,6.
Как и в случае с любой экспериментальной платформы, профилирование на основе ампликон можно ввести ряд потенциальных отклонений, которые должны быть рассмотрены в ходе экспериментального проектирования и анализа данных. К ним относятся методы сбора проб, ДНК добычи, отбора праймеры PCR, и как проводится подготовка библиотеки. Различные методы может существенно снизить количество используемых данных и может также затруднить усилия чтобы сравнить результаты исследований. Например метод удаления ризосферной бактерии7 и использование методов различных извлечения или выбор ДНК извлечения комплекты8,9 было показано значительное воздействие течению анализа, что приводит к различные выводы относительно которых микробы формируют настоящее и их относительного обилия. Поскольку можно настроить профилирование на основе ампликонами, делая сравнения различных исследований может быть сложным. Проект микрофлора земли предположил, что исследователи, изучение сложных систем, таких как завод связанные микрофлора выиграют от разработки стандартизированных протоколов как средства минимизации изменчивости, вызванных применением различные методы между исследования10,11. Здесь мы обсуждаем многие из вышеуказанных тем, и предложение предложения относительно наилучшей практики, где это уместно.
Протокол демонстрирует процесс сбора почвы, ризосфере и корень образцов из Сорго зерновое и извлечения ДНК, используя налаженные ДНК изоляции комплект11. Кроме того наш протокол включает в себя подробный ампликон последовательности рабочего процесса с использованием обычно используемых NGS платформы, для определения структуры бактериальных сообществ12,,1314. Этот протокол был утвержден для использования в широком диапазоне растений хостов в недавно опубликованном исследовании корней, ризосфере и связанных почвах 18 видов растения, включая15 гаолян, Zea mays и Triticum aestivum. Этот метод также были проверены для использования с другими маркерных генов, как свидетельствует его успешное применение к изучению грибковых ITS2 маркер гена в изучении агавы микрофлора16,17 и клубники микрофлора 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол показывает установленные трубопровода для изучения корня endosphere, ризосфере и почвы микробных композиции, от выборки поля Образец обработки и ниже по течению последовательности. Изучение связанных корня microbiomes представляет уникальные проблемы, из-за частично трудности, п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS поддерживается программой стипендий аспирантов исследований NSF.
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
- Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
- Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
- Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
- Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
- Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
- Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
- De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
- Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
- Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
- Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
- Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
- Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
- O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
- Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
- Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
- Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
- Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
- Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
- Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
- Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
- Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
- Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
- Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
- Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
- Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
