Жесткость измерения мягкого силикона субстратов для Mechanobiology исследований с использованием Widefield флуоресцентным микроскопом
Summary
Субстратов с жесткостью в диапазоне килопаскаль полезны для изучения реакции клеток физиологически соответствующей жесткости микро среды. Используя просто widefield флуоресцентным микроскопом, Юнга мягкие силиконовые гели могут быть определены с помощью отступов с подходящей сфере.
Abstract
Мягких тканей в организме человека, как правило, имеют жесткость в диапазоне килопаскаль (kPa). Соответственно силикона и гидрогелевые гибких подложках было доказано быть полезным субстратов для культивирования клеток в физической микроокружения, который частично имитирует условия в естественных условиях . Здесь мы представляем простой протокол для характеризующие модули Юнга изотропной линейной эластичной субстратов, обычно используется для mechanobiology исследования. Протокол состоит из подготовки субстрата мягкого силикона на Петри блюдо или жесткой силиконовые, покрытие верхней поверхности субстрата силикона с бусами Флюоресцентная, с помощью миллиметровой шкалы сферы для отступа верхней поверхности (по тяжести), визуализации люминесцентные Бусы на поверхности с отступом силикона с помощью микроскопа флуоресценции и анализ результирующего изображения для вычисления Юнга силиконовые подложки. Муфта верхней поверхности субстрата с белков внеклеточного матрикса модулей (кроме флуоресцентный бусины) позволяет силиконовые подложки легко использоваться для ячейки покрытия и последующие исследования, с помощью экспериментов микроскопии силы тяги. Использование жесткой силикона, вместо Петри блюдо, как основа мягкого силикона, позволяет использовать mechanobiology исследований с участием внешних стрейч. Конкретные преимуществом этого протокола является widefield флуоресцентным микроскопом, которая обычно доступна во многих лабораториях, основного оборудования, необходимого для выполнения этой процедуры. Мы демонстрируем это протокол путем измерения Юнга мягкого силикона субстратов различных упругих модулей.
Introduction
Клетки в мягких тканях находятся в микро среды, чьи жесткость находится в килопаскаль диапазона1, в отличие от культуры ткани блюда которого жесткость несколько порядков выше. Первые эксперименты с клетки на внеклеточная матрица белка покрытием мягкие субстраты показал, что жесткость субстрат влияет как клетки двигаться дальше, а также придерживаться внеклеточного матрикса под2,3. В самом деле субстрат жесткость принципиально влияет на функции клеток4 в аналогии с широко распространенной биохимических сигналы. Полиакриламидных гелей (покрытые белков внеклеточного матрикса) (вода проникая) гидрогели, широко использовались как клетки культуры субстратов для mechanobiology исследований5. Полидиметилсилоксан (PDMS), наиболее распространенных силиконовые (полисилоксан), широко используется как жесткая силикона с мегапаскаль диапазона жесткости для изготовления микрон шкала6. Совсем недавно, мягкого силикона, который субстратов с жесткостью в диапазоне более физиологически соответствующих килопаскаль были заняты в качестве подложки культуры клеток для mechanobiology исследования,78.
Некоторые методы были использованы для измерения жесткости гибких подложках, включая атомно-силовой микроскопии, макроскопической деформации всей образцов на растяжение, реологии и отступы с помощью сферы и сферически наконечником microindentors9 . Хотя каждая техника имеет свои преимущества и недостатки, отступы со сферой является особенно простой, но довольно точный метод, который требует только доступ к widefield флуоресцентным микроскопом. Отступы с металлический шар был использован для измерения жесткости гидрогели в предыдущие работы3,9,10. Ранние работы, которая продемонстрировала важность субстрат жесткость клеточного движения использовали этот метод для определения гидрогеля субстрата жесткость3. Совсем недавно конфокальная микроскопия используется также для элегантной характеристика10.
Здесь, мы представляем пошаговые протокол для подготовки субстрата мягкого силикона, муфты флуоресцентные бусины (и белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген я) только к верхней поверхности, воображения отступов сферы и верхней поверхности с использованием фазы и флуоресценции изображений, соответственно и, наконец, анализ изображений для вычисления Юнга силиконовые подложки. Мягкие силиконовые подложки, подготовленных таким образом легко может использоваться для тяговой силы микроскопии экспериментов. Использование жесткой силиконовые (вместо чашку Петри) как база для мягкого силикона также позволяет mechanobiology исследования с использованием внешних стрейч. Где это уместно, также указаны практические соображения, необходимые для предотвращения возможных осложнений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как сфера отступ метод прост в реализации, особое внимание должно уделяться выбор indentor и толщина мягкого силикона образца. Уравнение используется для вычисления Юнга действует под набор условий11и обычно они удовлетворены когда толщина образца силикона-> 10% от ра…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Гардель Маргарет за щедро позволяет использовать Реометр. Мы признаем поддержку от НИЗ (1R15GM116082), что позволило этой работы.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
