Medição da rigidez de substratos de Silicone macio para estudos de Mechanobiology, usando um microscópio de fluorescência Widefield
Summary
Substratos com rigidez na faixa de superfície são úteis para estudar a resposta das células à rigidez de microambiente fisiologicamente relevante. Usando apenas um microscópio de fluorescência widefield, o módulo de Young de gel de silicone suave pode ser determinado usando um recuo com uma esfera apropriada.
Abstract
Tecidos moles do corpo humano, normalmente, tem rigidez na faixa quilopascal (kPa). Nesse sentido, substratos flexíveis de silicone e hidrogel tem provados para ser útil substratos para cultivo de células em um microambiente física que imita parcialmente na vivo condições. Aqui, apresentamos um protocolo simples para caracterizar o módulo de Young de substratos de elásticos lineares isotrópicos normalmente utilizados para estudos de mechanobiology. O protocolo consiste em preparar um substrato de silicone macio em uma placa de Petri ou silicone duro, revestindo a superfície superior do substrato do silicone com grânulos fluorescentes, usando uma esfera de milímetro-escala para recuar a superfície superior (por gravidade), imagem latente da fluorescente grânulos na superfície do silicone recuado usando um microscópio de fluorescência e analisando as imagens resultantes para calcular o módulo de Young do substrato do silicone. A superfície superior do substrato de acoplamento com uma proteína de matriz extracelular moduli (além do que os grânulos fluorescentes) permite que o substrato do silicone a ser facilmente usado para chapeamento da célula e estudos posteriores usando experimentos de microscopia de força de tração. O uso de silicone duro, em vez de uma placa de Petri, como a base do silicone macio, permite o uso de mechanobiology estudos envolvendo trecho externo. Uma vantagem específica do presente protocolo é um microscópio de fluorescência widefield, que é comumente disponível em muitos laboratórios, os principais equipamentos necessários para este procedimento. Vamos demonstrar este protocolo medindo-se o módulo de Young de substratos de silicone suave de diferentes módulos elásticos.
Introduction
Células em tecidos moles residem em um microambiente cuja rigidez é o hectopascal gama1, em contraste com pratos de cultura de tecidos cuja rigidez é várias ordens de magnitude maior. Primeiras experiências com células em substratos de macio revestido de proteínas da matriz extracelular mostraram que a rigidez de substrato influencia como células seguir em frente, bem como aderirem à matriz extracelular abaixo de2,3. Na verdade, a rigidez de substrato influencia fundamentalmente a função celular4 de maneira semelhante aos sinais bioquímicos penetrante. Gel de poliacrilamida (revestido com proteínas da matriz extracelular) são (água-permeando) hidrogel que têm sido amplamente utilizados como substratos de cultura de células para estudos de mechanobiology5. Polydimethylsiloxane (PDMS), o mais comum do silicone (silicone), foi amplamente utilizado como um silicone duro com rigidez megapascal-gama para mícron-escala de fabricação6. Mais recentemente, silicone macio substratos com rigidez na faixa hectopascal mais fisiologicamente relevantes têm sido empregados como substratos de cultura celular para mechanobiology estudos7,8.
Vários métodos têm sido utilizados para medir a dureza de substratos flexíveis, incluindo microscopia de força atômica, a deformação macroscópica das amostras toda sobre o alongamento, reologia e recuo usando esferas e Ponta esférica microindentors9 . Enquanto cada técnica tem suas próprias vantagens e desvantagens, recuo com uma esfera é um método especialmente simples, mas bastante preciso que requer apenas o acesso a um microscópio de fluorescência widefield. Recuo com uma esfera metálica tem sido usado para medir a rigidez de hidrogel em trabalhos anteriores3,9,10. Primeiros trabalhos que demonstrou a importância da rigidez de substrato para o movimento de células utilizaram este método para determinar o hidrogel substrato rigidez3. Mais recentemente, microscopia confocal também tem sido usada para uma caracterização elegante10.
Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para preparar um substrato de silicone suave, acoplamento grânulos fluorescentes (e uma proteína da matriz extracelular como colágeno eu) só para a superfície superior, uma esfera de recuo e o topo usando superfície de imagem de fase e fluorescência de imagem, respectivamente e, finalmente, analisando as imagens para calcular o módulo de Young do substrato do silicone. O substrato de silicone suave preparado dessa maneira pode ser facilmente usado para experimentos de microscopia de força de tração. O uso de silicone duro (em vez de uma placa de Petri) como a base para o silicone macio também permite estudos de mechanobiology usando um trecho externo. Que tal se justifique, as considerações práticas necessárias para evitar possíveis complicações também são indicadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto o método de indentação de esfera é fácil de implementar, cuidado deve prestar atenção para a escolha de indentor e a espessura da amostra silicone macio. A equação utilizada para calcular o módulo de Young é válida sob um conjunto de condições11e estas normalmente são satisfeitas quando a espessura da amostra do silicone é > 10% do raio indentor e < ~ 13 x o raio indentor. Descobrimos que uma espessura do silicone de 5-10 x o raio indentor foi uma boa escolha, no qual a es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Margaret Gardel generosamente, permitindo o uso da rheometer. Reconhecemos o apoio do NIH (1R15GM116082) que permitiu a este trabalho.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
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