قياس صلابة من ركائز السيليكون لينة للدراسات ميتشانوبيولوجي باستخدام مجهر الأسفار ويديفيلد
Summary
ركائز مع تصلب في نطاق كيلوباسكال مفيدة لدراسة استجابة الخلايا لفسيولوجيا ذات الصلة الصغرى والبيئة صلابة. استخدام مجهر الأسفار ويديفيلد فقط، يمكن تحديد معامل للشباب من الهلام لينة سيليكون استخدام المسافة بادئة مع مجال مناسبة.
Abstract
الأنسجة الرخوة في جسم الإنسان وعادة ما يكون تصلب في نطاق كيلوباسكال (كيلو باسكال). بناء على ذلك، ثبت ركائز مرنة السيليكون والمائية لتكون ركائز مفيدة لاستزراع الخلايا في المكروية المادي الذي يحاكي جزئيا في فيفو الظروف. وهنا، يقدم بروتوكول بسيط لتميز بواقي للشباب من ركائز مطاطا خطي الخواص المستخدمة عادة للدراسات ميتشانوبيولوجي. يتكون البروتوكول من إعداد الركازة سيليكون ناعمة على طبق بيتري أو سيليكون قاسية، طلاء السطح العلوي للركيزة سيليكون مع الخرز الفلورسنت، واستخدام مجال ملليمتر-مقياس للمسافة البادئة السطح العلوي (بخطورة)، التصوير في فلوري الخرز على سطح السيليكون مسافة بادئة باستخدام مجهر الأسفار، وتحليل الصور الناتجة لحساب معامل للشباب من الركازة سيليكون. اقتران السطح العلوي للركيزة مع بروتين خارج الخلية مصفوفة بواقي (بالإضافة إلى الخرز الفلورسنت) يسمح الركيزة السيليكون يتم استخدامها بسهولة لطلاء الخلية والدراسات اللاحقة باستخدام تجارب الفحص المجهري قوة الجر. استخدام سيليكون قاسية، بدلاً من طبق بيتري، كالقاعدة السيليكون لينة، يمكن استخدام الدراسات ميتشانوبيولوجي التي تنطوي على امتداد خارجي. ميزة محددة من هذا البروتوكول هو مجهر الأسفار ويديفيلد، التي تتوفر عادة في العديد من المختبرات، المعدات الرئيسية اللازمة لتنفيذ هذا الإجراء. نظهر هذا البروتوكول عن طريق قياس معامل للشباب من ركائز السيليكون لينة من بواقي مطاطا مختلفة.
Introduction
الخلايا في الأنسجة الرخوة الموجودة في بيئة الجزئي الذي تصلب في كيلوباسكال مجموعة1، على النقيض من أطباق زراعة الأنسجة التي تصلب عدة أوامر من حجم أكبر. وأظهرت تجارب مبكرة مع الخلايا في المصفوفة خارج الخلية ركائز الناعمة المغلفة بالبروتين أن تصلب الركازة التأثيرات كيف الخلايا الانتقال، فضلا عن التمسك بالمصفوفة خارج الخلية تحت2،3. في الواقع، يؤثر تصلب الركازة أساسا وظيفة الخلية4 بطريقة مماثلة للإشارات البيوكيميائية انتشارا. المواد الهلامية polyacrylamide (مغلفة بالبروتينات المصفوفة خارج الخلية) (تتخلل المياه) الهلاميات المائية التي استخدمت على نطاق واسع كخلية ركائز الثقافة للدراسات ميتشانوبيولوجي5. بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، سيليكون الأكثر شيوعاً (polysiloxane)، قد استخدمت على نطاق واسع سيليكون قاسية مع تصلب ميجا باسكال-مجموعة ل تصنيع ميكرون-مقياس6. أكثر مؤخرا, لينة سيليكون ركائز مع تصلب في النطاق ذات الصلة أكثر فسيولوجيا كيلوباسكال وقد استخدمت كركائز ثقافة الخلية للدراسات ميتشانوبيولوجي7،8.
وقد استخدمت عدة أساليب لقياس صلابة ركائز مرنة، بما في ذلك مجهر القوة الذرية، تشوه العيانية عينات كاملة عليها، ريولوجيا، وتمتد المسافة البادئة باستخدام المجالات وكرويا مقلوب ميكرويندينتورس9 . بينما كل أسلوب له مزاياه وعيوبه، المسافة البادئة مع مجال هي طريقة خاصة بسيطة ولكنها دقيقة إلى حد ما فقط ويتطلب الوصول إلى مجهر الأسفار ويديفيلد. وقد استخدمت المسافة البادئة مع مجال معدني لقياس صلابة من الهلاميات المائية في الأعمال السابقة3،،من910. الأعمال المبكرة التي أثبتت أهمية صلابة الركيزة لحركة الخلية تستخدم هذا الأسلوب لتحديد المائية الركازة صلابة3. في الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا لتوصيف أنيقة10مجهرية [كنفوكل].
هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد الركازة سيليكون لينة، اقتران الخرز الفلورية (بروتين مصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين وأنا) فقط للسطح العلوي، التصوير مجالاً الطعج واستخدام السطح العلوي المرحلة و الأسفار التصوير، على التوالي، وأخيراً تحليل الصور لحساب معامل للشباب من الركازة سيليكون. يمكن أن تكون الركيزة السيليكون لينة أعد بهذه الطريقة استخدامها بسهولة لتجارب الفحص المجهري قوة الجر. كما يتيح استخدام سيليكون قاسية (بدلاً من طبق بيتري) كالقاعدة السيليكون لينة الدراسات ميتشانوبيولوجي باستخدام امتداد خارجي. متى استلزم الأمر ذلك، يتم أيضا الإشارة إلى الاعتبارات العملية اللازمة لتجنب المضاعفات المحتملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما يكون الأسلوب المسافة البادئة المجال سهلة التنفيذ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لاختيار إيندينتور وسمك العينة السيليكون لينة. المعادلة المستخدمة لحساب معامل للشباب يكون صالحاً بمقتضى مجموعة من الشروط11وهذه راضون عادة عندما يكون سمك العينة سيليكون > 10% من قيمة radius indentor و < ~ 13 × ن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر مارغريت غارديل للسماح باستخدام رهيوميتير سخاء. نعترف بدعم من المعهد الوطني للصحة (1R15GM116082) الذي مكن هذا العمل.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
