ركائز مع تصلب في نطاق كيلوباسكال مفيدة لدراسة استجابة الخلايا لفسيولوجيا ذات الصلة الصغرى والبيئة صلابة. استخدام مجهر الأسفار ويديفيلد فقط، يمكن تحديد معامل للشباب من الهلام لينة سيليكون استخدام المسافة بادئة مع مجال مناسبة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس صلابة من ركائز السيليكون لينة للدراسات ميتشانوبيولوجي باستخدام مجهر الأسفار ويديفيلد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأنسجة الرخوة في جسم الإنسان وعادة ما يكون تصلب في نطاق كيلوباسكال (كيلو باسكال). بناء على ذلك، ثبت ركائز مرنة السيليكون والمائية لتكون ركائز مفيدة لاستزراع الخلايا في المكروية المادي الذي يحاكي جزئيا في فيفو الظروف. وهنا، يقدم بروتوكول بسيط لتميز بواقي للشباب من ركائز مطاطا خطي الخواص المستخدمة عادة للدراسات ميتشانوبيولوجي. يتكون البروتوكول من إعداد الركازة سيليكون ناعمة على طبق بيتري أو سيليكون قاسية، طلاء السطح العلوي للركيزة سيليكون مع الخرز الفلورسنت، واستخدام مجال ملليمتر-مقياس للمسافة البادئة السطح العلوي (بخطورة)، التصوير في فلوري الخرز على سطح السيليكون مسافة بادئة باستخدام مجهر الأسفار، وتحليل الصور الناتجة لحساب معامل للشباب من الركازة سيليكون. اقتران السطح العلوي للركيزة مع بروتين خارج الخلية مصفوفة بواقي (بالإضافة إلى الخرز الفلورسنت) يسمح الركيزة السيليكون يتم استخدامها بسهولة لطلاء الخلية والدراسات اللاحقة باستخدام تجارب الفحص المجهري قوة الجر. استخدام سيليكون قاسية، بدلاً من طبق بيتري، كالقاعدة السيليكون لينة، يمكن استخدام الدراسات ميتشانوبيولوجي التي تنطوي على امتداد خارجي. ميزة محددة من هذا البروتوكول هو مجهر الأسفار ويديفيلد، التي تتوفر عادة في العديد من المختبرات، المعدات الرئيسية اللازمة لتنفيذ هذا الإجراء. نظهر هذا البروتوكول عن طريق قياس معامل للشباب من ركائز السيليكون لينة من بواقي مطاطا مختلفة.
المقدمة
الخلايا في الأنسجة الرخوة الموجودة في بيئة الجزئي الذي تصلب في كيلوباسكال مجموعة1، على النقيض من أطباق زراعة الأنسجة التي تصلب عدة أوامر من حجم أكبر. وأظهرت تجارب مبكرة مع الخلايا في المصفوفة خارج الخلية ركائز الناعمة المغلفة بالبروتين أن تصلب الركازة التأثيرات كيف الخلايا الانتقال، فضلا عن التمسك بالمصفوفة خارج الخلية تحت2،3. في الواقع، يؤثر تصلب الركازة أساسا وظيفة الخلية4 بطريقة مماثلة للإشارات البيوكيميائية انتشارا. المواد الهلامية polyacrylamide (مغلفة بالبروتينات المصفوفة خارج الخلية) (تتخلل المياه) الهلاميات المائية التي استخدمت على نطاق واسع كخلية ركائز ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تلفيق الركازة السيليكون لينة
- وزن أصل 1.75 ز المكون A و g 1.75 العنصر ب (A:B = 1:1) من السيليكون لينة الاستومر kit (البوليسترين) باستخدام وزنها الصواني.
- إضافة المكون A إلى المكون ب في علبة وزنها ومزجها معا لمدة 5 دقائق عصا قضيب مناسبة باستخدام.
- إضافة الخليط أعلاه إلى 35 مم طبق بيتري. السماح الخليط أن تنتشر بالتساوي عبر صحن بيتري لبضع دقائق.
ملاحظة: اختيار قطر طبق بيتري ومقدار السيليكون لينة ستحدد سماكة السيليكون لينة. وهنا سوف يكون السمك حوالي 3.5 مم؛ مزيد من المعلومات حول اختيار سمك الاستومر في جزء المناقشة . - ضع طبق بيتري مع خليط السيليكون، مع الغطاء قبالة، في فراغ غرفة لمدة 15 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام بروتوكول المفصلة أعلاه، نحن إعداد السيليكون لينة في 35 مم طبق بيتري والشفاء عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإلى جانب ميكروبيدس نيون (والكولاجين وأنا) إلى السطح العلوي تخطيطياً كما مبين في الشكل 1. وقد استخدمت الأشعة فوق البنفسجية العميقة سابقا للبروتين في نهاية المطاف اقتران لركائز13. لاحظ أن (ط) شروط المعالجة المستخدمة هنا محددة لهذا السيليكون لينة ويتم تنفيذ (الثاني) بقياس المسافة البادئة في اليوم التالي كما متوقع السيل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بينما يكون الأسلوب المسافة البادئة المجال سهلة التنفيذ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لاختيار إيندينتور وسمك العينة السيليكون لينة. المعادلة المستخدمة لحساب معامل للشباب يكون صالحاً بمقتضى مجموعة من الشروط11وهذه راضون عادة عندما يكون سمك العينة سيليكون > 10% من قيمة radius indentor و < ~ 13 × نصف قطرها إيندينتور. وجدنا أن سمك سيليكون x 5-10 دائرة نصف قطرها إيندينتور كان اختياراً جيدا، حيث سمك العينة ليست عالية جداً (أيالمسافة العامل الموضوعي لم يصبح القيد) وتصلب المحسوبة ليست حساسة للغاية القيمة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر مارغريت غارديل للسماح باستخدام رهيوميتير سخاء. نعترف بدعم من المعهد الوطني للصحة (1R15GM116082) الذي مكن هذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| CY 52-276 A / B طقم المطاط الصناعي السيليكون | Dow Corning | CY 52-276 | يخزن في درجة حرارة الغرفة |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store عند -20 درجة ؛ ج |
| ثيرمو علمية بيرس سولفو-NHS متشابك | فيشر Scientific | PI-24510 | مخزن في 4 درجة ؛ C |
| جزيئات الوردي الفلورية كربوكسيل ، 0.4-0.6 & م ، 2 مل | Spherotech، Inc. | CFP-0558-2 | تخزين في 4 درجة ؛ C ، لا تجمد |
| 1.0 مم حبات الزركونيوم المغسولة بالحمض | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| غرفة الأشعة فوق البنفسجية العميقة مع جهاز تفريغ الأوزون | Novascan Technologies، Inc. | PSD-UV4 ، OES-1000D | |
| مجهر مضان واسع المجال | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I ، من ذيل الفئران | Corning | 354236 | تركيز المخزون = 4 مجم / مل ؛ تخزينها في 4 درجة ؛ C |
| برنامج المجال العام | ImageJ-NIH | N / A | / A |
المراجع
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesion....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
