Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için
Summary
Yüzeyler ile sertlik kilopascal aralıktaki hücreler yanıt fizyolojik ilgili mikro-çevre sertlik olarak çalışmaya yararlıdır. Sadece bir widefield floresan mikroskop kullanarak, yumuşak silikon jelleri, Young katsayısı ile uygun bir küre bir girinti kullanarak belirlenebilir.
Abstract
İnsan vücudunda yumuşak dokular genellikle kilopascal (kPa) aralığında sertlik var. Buna göre silikon ve hidrojel esnek yüzeylerde kısmen vivo içinde koşulları taklit eden bir fiziksel microenvironment hücrelerde kültür için yararlı yüzeylerde olmak kanıtlanmış oldu. Burada, Young’ın dönmeler izotropik doğrusal elastik yüzeyler genellikle mechanobiology çalışmaları için kullanılan, karakterize için basit bir protokol mevcut. Protokol bir Petri kabına veya sert silikon yumuşak silikon yüzey hazırlama, silikon substrat floresan boncuklar ile üst yüzey kaplama, floresan Imaging üst yüzeyi (yerçekimi) tarafından girintilemek için bir milimetre çaplı küre kullanarak oluşur boncuk floresan mikroskop kullanarak ve Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için sonuç görüntüleri analiz girintili silikon yüzeyi. Substrat’ın üst yüzeyi dönmeler hücre dışı matriks proteini (ek floresan boncuklar) ile kaplin kolayca sonraki çalışmalar traksiyon kuvvet mikroskobu deneyler kullanarak ve hücre kaplama için kullanılmak üzere silikon yüzey sağlar. Yumuşak silikon temeli olarak bir petri yerine sert silikon kullanımı dış streç içeren mechanobiology çalışmalar kullanımını etkinleştirir. Bu iletişim kuralı belirli bir avantajı birçok laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılabilir, widefield floresan mikroskop büyük ekipman bu yordam için gerekli olmasıdır. Biz bu iletişim kuralı, yumuşak silikon yüzeylerde farklı elastik dönmeler, Young katsayısı ölçerek göstermek.
Introduction
Yumuşak doku hücrelerinde bir mikro-kimin sertlik kilopascal Aralık1, doku kültürü yemekleri olan sertlik büyüklükte birkaç emir daha yüksek olduğunu aksine ortamı yer alır. Hücre dışı matriks proteini kaplı yumuşak yüzeylerde hücrelerdeyse ile erken deneyler yüzey sertliği nasıl hücreleri üzerinde hareket yanı sıra2,3altında hücre dışı matriks uygun etkiler gösterdi. Aslında, yüzey sertliği temelde yaygın biyokimyasal sinyalleri için benzer bir şekilde hücre fonksiyonu4 etkiler. Polyacrylamide (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplı) jelleri (su-permeating) kapsamlı5mechanobiology çalışmalar için kültür yüzeylerde hücre olarak kullanılmış olan hydrogels. POLYDİMETHYLSİLOXANE (PDMS), en sık kullanılan silikon (polysiloxane), yaygın sert bir silikon ile megapascal menzilli sertlik mikron ölçekli imalat6için kullanılmıştır. Son zamanlarda, daha yumuşak silikon yüzeyler ile sertlik daha fizyolojik ilgili kilopascal aralığındaki hücre kültür yüzeyler için mechanobiology çalışmalar7,8olarak istihdam edilmiştir.
Atomik kuvvet mikroskobu, makroskopik deformasyon küreler kullanarak ve küresel microindentors9 uçlu depoladığınız ve Reolojisi, germe üzerine tüm örnekleri de dahil olmak üzere esnek yüzeylerde sertliği ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır . Her tekniği kendine özgü avantajları ve dezavantajları olsa da, girinti bir küre ile yalnızca erişmesi gereken widefield floresan mikroskop bir özellikle basit ama oldukça doğru yöntemdir. Girinti metalik bir küre ile ön çalışma3,9,10hydrogels sertliği ölçmek için kullanılmaktadır. Yüzey sertliği hücre hareketi için önemini gösterdi erken dönem çalışmaları hidrojel yüzey sertliği3belirlemek için bu yöntemi kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, confocal mikroskobu da zarif karakterizasyonu10için kullanılmıştır.
Burada, floresan boncuk kaplin yumuşak silikon yüzey hazırlama adım adım bir iletişim kuralı mevcut (ve bir hücre dışı matriks protein kollajen gibi ben) düşsel bir indenting küre ve üst yüzey kullanarak sadece üst yüzeye, faz ve Imaging, sırasıyla ve nihayet Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için görüntüleri analiz floresan. Bu şekilde hazırlanan yumuşak silikon substrat çekiş kuvveti mikroskopisi deneyler için kolayca kullanılabilir. Yumuşak silikon üs olarak (yerine bir petri) sert silikon kullanımı da mechanobiology çalışmaları harici bir streç kullanarak sağlar. Garanti nerede pratik hususlar komplikasyonlar kaçınmak için gerekli ayrıca belirtilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Küre girinti yöntemi uygulamak çok kolay olmakla birlikte, indentor seçimi ve yumuşak silikon örnek kalınlığı dikkat ödenmelidir. Denklem Young katsayısı hesaplamak için kullanılan birtakım koşullar11altında geçerli olduğundan ve silikon örnek kalınlığı > %10 indentor yarıçap olduğunda bunlar genellikle memnun musunuz ve < ~ 13 x indentor yarıçapı. 5-10 x silikon kalınlığı indentor RADIUS neyin örnek kalınlığı çok yüksek değil iyi bir seçim olduğunu ort…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Margaret Gardel cömertçe rheometer kullanımına izin verdiğiniz için teşekkür ederim. Bu eser etkin NIH (1R15GM116082) destek anıyoruz.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
