Mesure de la rigidité des substrats souples en Silicone pour mécanobiologie études utilisant un Microscope à Fluorescence Widefield
Summary
Substrats avec raideur dans la gamme kilopascal sont utiles pour étudier la réponse des cellules à physiologiquement pertinente micro-environnement rigidité. À l’aide d’un microscope à fluorescence widefield juste, le module de Young des gels de silicone souple peut être déterminé en utilisant une mise en retrait avec une sphère adaptée.
Abstract
Des tissus mous dans le corps humain ont généralement des raideurs dans la gamme kilopascal (kPa). En conséquence, les substrats flexibles silicone et hydrogel sont est avérés pour être utiles substrats de culture de cellules dans un micro-environnement physique qui reproduit partiellement des conditions in vivo . Nous présentons ici un protocole simple pour la caractérisation des modules de Young des substrats d’élastiques linéaires isotropes, généralement utilisés pour les études de mécanobiologie. Le protocole consiste à préparer un substrat de silicone souple sur une boîte de Pétri ou silicone rigide, revêtement de la surface supérieure du substrat silicone avec perles fluorescentes, à l’aide d’une sphère à l’échelle du millimètre en retrait de la surface supérieure (par gravité), imagerie de la fluorescence Perles à la surface du silicone en retrait à l’aide d’un microscope à fluorescence et d’analyser les images qui en résultent pour calculer le module de Young du substrat silicone. Couplage de la surface supérieure du substrat avec une protéine de la matrice extracellulaire de modules (outre les perles fluorescentes) permet le substrat de silicone pour être facilement utilisables pour le placage de la cellule et les études ultérieures à l’aide d’expériences de microscopie de force de traction. L’utilisation du silicone rigide, au lieu d’une boîte de Pétri, comme la base de la silicone souple, permet l’utilisation de mécanobiologie études impliquant les tronçon externe. Un avantage spécifique de ce protocole est qu’un microscope widefield à fluorescence, qui est couramment disponible dans nombreux laboratoires, est l’équipement principal nécessaire pour cette procédure. Nous démontrons ce protocole en mesurant le module de Young des substrats souples en silicone de différents coefficients d’élasticité.
Introduction
Les cellules dans les tissus mous se trouvent dans un micro-environnement dont la raideur est dans le kilopascal rang1, à la différence de culture de tissus plats dont la raideur est de plusieurs ordres de grandeur plus élevés. Premières expérimentations avec des cellules sur des substrats mous enduit de protéine de matrice extracellulaire ont montré que la rigidité du substrat influence comment les cellules se déplacent ainsi qu’adhèrent à la matrice extracellulaire sous2,3. En effet, la rigidité du substrat influence fondamentalement la cellule fonction4 d’une manière similaire aux signaux biochimiques omniprésentes. Les gels de polyacrylamide (recouverts de protéines de la matrice extracellulaire) sont (eau-imprégnant) hydrogels qui ont été largement utilisés comme substrats de culture de cellules pour mécanobiologie études5. Polydiméthylsiloxane (PDMS), la plus courante silicone (polysiloxane), a été employé couramment comme un silicone rigide avec raideur megapascal-gamme pour micron-échelle fabrication6. Plus récemment, silicone souple substrats avec raideur dans la gamme kilopascal plus physiologiquement pertinents ont été employées comme substrats de culture cellulaire pour la mécanobiologie études7,8.
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour mesurer la rigidité des substrats flexibles, y compris la microscopie à force atomique, déformation macroscopique des échantillons tout étirement, rhéologie et de mise en retrait à l’aide de sphères et sphérique à pointe microindentors9 . Alors que chaque technique a ses propres avantages et inconvénients, entaille à l’aide d’une sphère est une méthode particulièrement simple mais assez précise qui ne nécessite que l’accès à un microscope à fluorescence widefield. Entaille à l’aide d’une sphère métallique a été utilisée pour mesurer la rigidité des hydrogels dans un travail préalable3,9,10. Les premiers travaux qui ont démontré l’importance de la rigidité du substrat à mouvement cellulaire utilisé cette méthode pour déterminer l’hydrogel substrat raideur3. Plus récemment, microscopie confocale a également été utilisée pour une caractérisation élégant10.
Nous présentons ici un protocole étape par étape pour la préparation d’un substrat de silicone souple, couplage perles fluorescentes (et une protéine de la matrice extracellulaire comme le collagène je) juste à la surface supérieure, une sphère d’indentation et la surface supérieure en utilisant l’imagerie phase et fluorescence imaging, respectivement et enfin analyser les images pour calculer le module de Young du substrat silicone. Le substrat de silicone souple préparé de cette manière peut être facilement utilisé pour expériences de microscopie de force de traction. L’utilisation du silicone rigide (au lieu d’une boîte de Pétri) comme la base pour le silicone souple permet également aux études mécanobiologie utilisant un étirement externe. Lorsque cela est justifié, des considérations pratiques nécessaires pour éviter les complications possibles sont également indiquées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que la méthode de mise en retrait de sphère est facile à mettre en œuvre, une attention particulière est versée pour le choix du pénétrateur et l’épaisseur de l’échantillon de silicone souple. L’équation utilisée pour calculer le module de Young est valide en vertu d’un ensemble de conditions11et ceux-ci sont généralement remplies lorsque l’épaisseur de l’échantillon de silicone est > 10 % du rayon indenteur et < ~ 13 x le rayon indenteur. Nous avons constaté qu?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Margaret Gardel généreusement permettant l’utilisation du rhéomètre. Nous reconnaissons l’appui du NIH (1R15GM116082) qui ont permis ce travail.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
