Stivhed måling af blød silikone underlag for Mechanobiology undersøgelser ved hjælp af en Widefield fluorescens mikroskop
Summary
Substrater med stivhed i kilopascal-området er nyttige at studere svar af celler til fysiologisk relevante mikro-miljø stivhed. Bruger bare en widefield fluorescens mikroskop, kan de unge modulus af blød silikone gel bestemmes ved hjælp af en indrykning med en egnet kugle.
Abstract
Bløde væv i den menneskelige krop har typisk stivhed i rækken kilopascal (kPa). I overensstemmelse hermed, silikone og hydrogel fleksible substrater har vist sig for at være nyttig substrater til dyrkning af celler i en fysisk mikromiljø, der delvist efterligner i vivo betingelser. Her præsenterer vi en enkel protokol for karakteriserer de unge moduli isotropic lineær elastisk underlag bruges typisk til mechanobiology undersøgelser. Protokollen består af forbereder en blød silikone underlag på en petriskål eller stiv silikone, belægning oversiden af silikone underlag med fluorescerende perler, ved hjælp af en millimeter-skala kugle til at indrykke den øverste overflade (af tyngdekraften), imaging fluorescerende perler på indrykket silikone overflade ved hjælp af et fluorescens mikroskop, og analysere de resulterende billeder for at beregne de unge modulus af silikone substrat. Kobling af substratet øverste overflade moduli ekstracellulære matrix protein (ud over de fluorescerende perler) tillader silikone substrat til let anvendes for celle plating og efterfølgende undersøgelser ved hjælp af trækkraft force mikroskopi eksperimenter. Brug af stive silikone, i stedet for en petriskål, som bunden af den bløde silikone, muliggør brug af mechanobiology undersøgelser, hvor eksterne strækning. En særlig fordel i denne protokol er en widefield fluorescens mikroskop, som er almindeligt tilgængelige i mange laboratorier, store nødvendigt udstyr til denne procedure. Vi demonstrere denne protokol ved at måle de unge modulus af blød silikone substrater af forskellige elastiske moduli.
Introduction
Celler i bløddele opholde sig i et mikro-miljø, hvis stivhed er i kilopascal række1, i modsætning til vævskultur retter hvis stivhed er flere størrelsesordener højere. Tidlige eksperimenter med celler på ekstracellulære matrix protein-coated soft substrater viste, at substrat stivhed påvirker hvordan celler videre samt overholde den ekstracellulære matrix under2,3. Faktisk påvirkninger substrat stivhed fundamentalt celle funktion4 på samme måde som at pervasive biokemiske signaler. Polyacrylamidgeler (belagt med ekstracellulære matrix proteiner) er (vand-trænger) hydrogels, der har været flittigt brugt som celle kultur substrater for mechanobiology undersøgelser5. Polydimethylsiloxan (PDMS), den mest almindelige silikone (polysiloxane), har været meget anvendt som en stiv silikone med megapascal-range stivhed til mikro-skala fabrikation6. For nylig, blød silikone underlag med stivhed i området mere fysiologisk relevante kilopascal er blevet ansat som celle kultur substrater for mechanobiology undersøgelser7,8.
Flere metoder er blevet brugt til at måle stivhed af fleksible substrater, herunder atomic force mikroskopi, makroskopiske deformation af hele prøver ved stretching, reologi og indrykning ved hjælp af kugler og sfærisk tippes microindentors9 . Mens hver metode har sine egne fordele og ulemper, er indrykning med en kugle en især enkle, men forholdsvis nøjagtige metode, som kun kræver adgang til en widefield fluorescens mikroskop. Indrykning med en metallisk kugle er blevet brugt til at måle stivhed af hydrogels i forudgående arbejde3,9,10. Tidlige arbejde, der demonstrerede betydningen af substrat stivhed til celle bevægelse udnyttet denne metode til at bestemme hydrogel substrat stivhed3. Mere nylig, Konfokal mikroskopi er også blevet brugt til en elegant karakterisering10.
Vi præsenterer her, en trinvis protokol for at forberede en blød silikone substrat, kobling fluorescerende perler (og en ekstracellulære matrix protein som kollagen jeg) bare til den øverste overflade, imaging en indrykning sfære og den øverste overflade bruger fase og Fluorescens imaging, henholdsvis, og endelig analysere billeder for at beregne de unge modulus af silikone substrat. Den bløde silikone substrat forberedt på denne måde kan let anvendes til trækkraft force mikroskopi eksperimenter. Brug af stive silikone (i stedet for en petriskål) som base for den bløde silikone giver også mulighed for mechanobiology undersøgelser ved hjælp af en ekstern strækning. Hvor det er berettiget, er praktiske overvejelser nødvendige for at undgå mulige komplikationer også angivet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens sfære indrykning metode er nem at implementere, skal omhyggelig opmærksomhed betales til valg af indentor og den bløde silikone tykkelse. Ligningen bruges til at beregne de unge modulus er gyldig i henhold til et sæt af betingelser11og disse er typisk opfyldt når tykkelsen af silikone prøven er > 10% af indentor radius og < ~ 13 x indentor radius. Vi fandt, at en silikone tykkelse på 5-10 x indentor radius var et godt valg, hvori prøven tykkelse ikke er for høje (dvs.den obj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Margaret Gardel for generøst mulighed for anvendelse af rheometer. Vi anerkender støtte fra NIH (1R15GM116082), der gjorde dette arbejde.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
