髓轴突原位光谱 Reflectometric 显微术
Summary
在这里, 我们提出了一个分步协议的成像髓轴突在固定脑切片使用无标签的纳米尺度成像技术的基础上的光谱反射。
Abstract
在哺乳动物神经系统中, 髓鞘通过将轴突纤维包裹成多层螺旋来提供电绝缘。在其高度组织的亚细胞体系结构的启发下, 我们最近开发了一种新的成像方式, 命名为光谱反射 (SpeRe), 它能够实现前所未有的无标签的现场髓轴突的纳米级成像。其基本原理是通过对多层亚细胞结构的反射谱进行分析, 获得纳米信息。在本文中, 我们描述了一个详细的分步协议, 以执行一个基本的 SpeRe 成像的神经组织使用一个商业共焦显微系统, 配备了白光激光器和可调谐滤波器。本文介绍了样品制备、光谱数据采集、图像处理等程序, 以获取纳米信息。
Introduction
在哺乳动物神经系统中, 髓鞘通过将轴突纤维包裹成多层膜鞘来提供快速的神经传导和轴突完整性。其多层结构由由等离子膜 (5 纳米)、细胞质 (~ 3 nm) 和胞外空间 (~ 7 nm)1、2组成的交替纳米薄膜组成。光学显微术, 包括最近的超分辨率显微镜, 不适合观察纳米髓鞘动力学, 由于其分辨率不足, 由于光学衍射3,4,5。尽管电子显微镜可以提供髓鞘纳米结构的细微细节, 但由于具有化学固定和 ultrasectioning6、7的高侵入性样品制剂, 它与生物系统不相容..直到最近, 还没有一种技术适用于髓轴突的纳米级动态观测。
Schain等人此前曾报道, 髓轴突呈现彩色光反射率8。通过对反射光的光谱分析, 我们设计了一种新的成像方式, 用于髓轴突的纳米成像, 称为光谱反射 (SpeRe)9。SpeRe 是基于在髓鞘多层结构中发生的薄膜干扰 (图 1)。通过对各种轴突的光学模拟, 揭示了反射谱是波数的周期性函数, 其周期性 (
) 与轴突直径 (d) 成反比。这种简单的关系
() 提供了 SpeRe 数据的轴突直径的简便量化。利用这一点, 我们发现在我们的前报告中, 在轻度外伤性颅脑损伤下的流行轴突肿胀。
SpeRe 系统以共焦显微镜为基础, 由专门的激光源和过滤器组成 (图 2)。输入源是白光激光器, 提供了红外区域可见的宽带频谱输出。对于光谱扫描, 系统配备两个声光器件: 一种声光可调谐滤波器 (AOTF), 用于从输入宽带源和声光光束分配器 (AOBS) 中传送选定的波长, 以指导选定的反射波长到探测器。高光谱共焦显微镜软件 (见材料表) 提供了一个可定制的光谱扫描选项, 以顺序获取各种输入波长的反射图像。此外, 色差能严重干扰光谱测量;因此, 建议使用复消色差物镜。
注意, 白光激光器产生不均匀的光谱输出, 光学元件也影响光谱剖面。因此, 需要对获得的光谱进行校准, 以便随后进行定量分析。受保护的银镜通常用作参考, 在整个可见区域上提供几乎恒定的反射率 (> 97%)。获得的光谱然后除以参考光谱从镜子。
光谱扫描的光谱步长决定了采集速度;因此, 它需要进行优化。由于一个较大的轴突具有较高的频谱周期, 它需要更精细的光谱取样。例如, 一个直径为10µm 的轴突, 是最大的生理轴突之一, 其光谱周期为 ~ 8 nm。应用采样标准, 采用 4 nm 的光谱采样间隔, 覆盖了小鼠神经组织的所有生理轴突。这种方法通常需要几秒钟的全光谱扫描, 因此不适合在体内应用, 其中生理运动 (如呼吸和心跳) 干扰稳定的光谱习得。我们以前通过检测一个自定义的垂直显微镜来解决这个问题, 它设计为每个点使用阵列光谱仪 (采集速度≈每像素30毫秒) 获得全部频谱。
在本报告中, 我们描述了一个关于固定脑切片的 SpeRe 成像的详细协议, 可以在商业高光谱显微镜下进行 (见材料表)。因此, 该协议可以由没有光学仪器专业知识的实验者完成。我们还讨论了 SpeRe 数据的获取和分析的潜在问题和疑难解答。
Protocol
Representative Results
Discussion
SpeRe 是一种新的基于光谱干涉的无标签成像模式, 它首次提供了实时髓轴突中的纳米尺度信息。在当前的采集协议中, 轴突直径的空间分辨率为 10 nm。此外, SpeRe 利用数量级较低的光剂量比其他超分辨率镜;因此, 它是免费的毒性和漂白。SpeRe 将为研究髓轴突的纳米级动力学提供一个新的途径。
本文所描述的协议是基于声光学和点探测器 (即PMT) 介导的光谱扫描。该方法有?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了基础科学研究所 (IBS-R015-D1) 和由教育部 (2017R1A6A1A03015642) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 的基础科学研究项目的支持。
Materials
| Glass cutter | – | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | – | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | – |
| Matlab | MathWorks | – | – |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | – |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | – |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | – |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
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