Myelinated akson in Situ üzerinde spektral Reflectometric mikroskobu
Summary
Burada, myelinated aksonlar üzerinde spektral reflectometry dayalı teknik görüntüleme bir etiket ücretsiz Nano kullanarak sabit beyin dilim içinde görüntüleme için adım adım bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Memeli bir sinir sisteminde miyelin axon lifler çok katmanlı bir sarmal içinde enwrapping tarafından bir elektrikli yalıtım sağlar. Son derece organize hücre altı mimarisi esinlenerek, biz son zamanlarda geliştirilen canlı myelinated akson içinde in situbenzeri görülmemiş etiket ücretsiz Nano görüntüleme sağlayan spektral reflectometry (SpeRe), adlı yeni bir görüntüleme yöntemidir. Temel prensibi çok katmanlı hücre altı yapısı yansıma spektrum analiz ederek nanostructural bilgi elde etmektir. Bu makalede, biz bir temel SpeRe görüntüleme bir beyaz ışık lazer ve ayarlanabilir bir filtre ile donatılmış bir ticari confocal mikroskobik sistemiyle sinir dokuları gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım protokol tanımlamak. Biz numune hazırlama, spektral verileri ve görüntü nanostructural bilgi almak için işleme yordamları kapsar.
Introduction
Memeli sinir sisteminde miyelin hızlı sinir iletim ve aksonal bütünlüğü axon lifleri çok katmanlı zar kılıfı ile enwrapping tarafından sağlar. Çok katmanlı yapısı nano ince plazma zarı oluşur filimler alternatif oluşmaktadır (~ 5 nm), sitozol (~ 3 nm) ve hücre dışı alanlarda (~ 7 nm)1,2. Optik mikroskobu son süper çözünürlük mikroskobu, dahil olmak üzere, nano miyelin dinamikleri nedeniyle optik kırınım3,4,5onların yetersiz çözünürlük nedeniyle gözlemlemek için uygun değildir. Elektron mikroskobu miyelin nanostructure ince detaylar sağlamasına karşın, kimyasal fiksasyonu ve ultrasectioning6,7 içeren son derece invaziv örnek hazırlıkları nedeniyle yaşayan biyolojik sistemler ile uyumlu. . Yakın zamana kadar ortada hiçbir teknik myelinated akson içinde in situdinamikleri nano gözlemlemek için uygulanabilir.
Schain ve ark. daha önce myelinated akson renkli ışık yansıma8sergi bildirdi. Yansıyan ışık spektroskopik analizine benimseyerek, yeni bir görüntüleme yöntemidir myelinated akson, spektral reflectometry (SpeRe)9adlı nano görüntüleme için tasarladılar. SpeRe miyelin Kılıf (Şekil 1) çok katmanlı yapısı içinde meydana gelen ince film girişim temel alır. Çeşitli aksonlar üzerinde optik simülasyon tarafından biz-si olmak kâşif yansıma spektrum wavenumber ve onun periyodik olarak periyodik bir fonksiyonudur (
) akson çapı (d) ters orantılıdır. Bu basit ilişki (
) akson çapı facile miktar SpeRe verileri sunar. Bu kullanmak, hafif travmatik beyin hasarı bizim önceki rapor altında şişkin yaygın axon ortaya koydu.
SpeRe sistemi confocal mikroskobu dayanmaktadır ve özel Lazer kaynağı oluşur ve filtreler (Şekil 2). Geniş bant spektral çıkış için kızılötesi bölgeleri görünür sağlayan bir beyaz ışık lazer giriş kaynağıdır. Spektral tarama sistemi iki acousto optik cihazlarla donatılmıştır: Seçili yol gösterici yansıyan için seçili bir dalga boyu giriş geniş bant kaynağı ve bir acousto-optik ışın splitter (AOBS) teslim etmek için bir acousto-optik ayarlanabilir filtresi (AOTF) belgili tanımlık bulmak için dalga boyu. Hyperspectral confocal mikroskobu ( Tablo malzemelerigörmek) sırayla çeşitli giriş dalga boylarında, yansıma görüntüleri elde etmek için özelleştirilebilir spektral tarama seçeneği sunar. Buna ek olarak, renk sapmaları eleştirel spektral ölçüm engelleyebilir; Bu nedenle, bir apochromat objektif lens kullanılması tavsiye edilir.
Dikkat, beyaz ışık lazerler düzensiz bir spektral çıktı üretmek ve optik bileşenleri de spektral profil etkiler. Bu nedenle, alınan spectra sonraki kantitatif analiz için ayarlanması gerekir. Korumalı bir gümüş ayna genellikle tam görünür bölge üzerinde hemen hemen sürekli yansıma (> % 97’si) sağlayan bir başvuru olarak kullanılır. Edinsel spectra sonra ayna üzerinden başvuru spectra tarafından ayrılır.
Spektral tarama için spektral adım boyu edinme hızını belirler; Bu nedenle, optimize edilmiş olması gerekir. Bir daha yüksek spektral dönemi büyük bir akson vardır gibi ince spektral örnekleme gerektirir. Örneğin, bir akson 10 µm, en büyük fizyolojik aksonlar biri büyüklüğündeki bir spektral ~ 8 vardır nm. Nyquist örnekleme ölçüt uygulayarak, çalıştırmaya başladık spektral örnekleme aralığı 4 nm fare sinir dokularında fizyolojik aksonlar kapsayacak. Bu yaklaşım genellikle birkaç saniye boyunca tam spektral tarama devre dışı bırakır ve böylece nerede fizyolojik hareket (Örneğin solunum ve kalp atışı) istikrarlı spektral edinme müdahale vivo uygulamaları için uygun değildir. Daha önce bu sorunu bir dizi spektrometre (satın alma hızı ≈ 30 ms her piksel için) kullanarak her noktası için tam spektrum elde etmek için tasarlanmış özelleştirilmiş dik mikroskop, işaretleme tarafından çözüldü.
Bu raporda, biz SpeRe görüntüleme bir ticari hyperspectral mikroskobu gerçekleştirilebilir bir sabit beyin dilim üzerinde detaylı bir protokol tanımlamak ( Tablo malzemelerigörmek). Böylece, protokol Denemecileri optik Araçları’nda uzmanlık olmadan tarafından tamamlanabilir. Biz de olası sorunları ve satın alma ve SpeRe veri analizi için sorun giderme kapsar.
Protocol
Representative Results
Discussion
SpeRe canlı myelinated akson nano bilgileri sunan ilk kez spektral Interferometry dayalı bir yeni etiket içermeyen görüntüleme yöntemi var. Geçerli edinme protokolünde, akson çapı için uzamsal çözünürlük 10 sipariş olduğunu nm. Ayrıca, SpeRe diğer süper çözünürlük microscopies göre büyüklüğü Siparişler alt hafif doz kullanır; Böylece, fototoksisite ve photobleaching ücretsizdir. SpeRe myelinated akson dinamikleri nano eğitimi için yeni bir cadde sağlayacaktır.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tarafından temel bilim Enstitüsü (IBS-R015-D1) ve temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı (2017R1A6A1A03015642) tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Glass cutter | – | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | – | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | – |
| Matlab | MathWorks | – | – |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | – |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | – |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | – |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
References
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?. Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
