Чувствительным измерение Mitophagy, поток цитометрии с помощью РН зависимых флуоресцентные репортер mt-Keima
Summary
Mitophagy, селективный деградации митохондрий, был вовлечен в митохондриальной гомеостаза и дерегулирование в различных заболеваний человека. Однако удобный экспериментальные методы для измерения активности mitophagy весьма ограничены. Здесь мы предоставляем чувствительных анализа для определения mitophagy активности с помощью проточной цитометрии.
Abstract
Mitophagy представляет собой процесс селективного удаления поврежденных или ненужные митохондрий, с использованием машин autophagy. Тесные связи были найдены между дефектных mitophagy и различных заболеваний человека, включая нейродегенеративные заболевания, рак и болезни обмена веществ. Кроме того недавние исследования показали, что mitophagy участвует в нормальных клеточных процессах, например дифференциация и развития. Однако конкретная роль и лежащих в основе mitophagy молекулярные механизмы требуют дальнейшего изучения. Таким образом крайне важно разработать надежный и удобный способ для измерения изменений в mitophagy деятельности. Здесь мы описываем подробный протокол для количественной оценки mitophagy деятельность через проточной цитометрии, с помощью ориентированных на митохондрии флуоресцентный белок Keima (mt-Keima). Этот assay цитометрии потока можно анализировать mitophagy более быстро и деликатно, чем обычные микроскопия – или immunoblotting-на основе методов. Этот протокол может применяться для анализа mitophagy активности в различных типах клеток.
Introduction
Митохондрии являются органеллы, которые необходимы для пролиферации клеток и физиологии. Митохондрии отвечают за создание более чем 80% поставок СПС через окислительное фосфорилирование, и они также предоставляют различные метаболические интермедиатов для биосинтеза и метаболизм1,2. Помимо их роли в энергоснабжении и метаболизм митохондрии играют центральную роль во многих других важных процессах, включая реактивнооксигенных видов (ров) поколения, регулирование клеточной смерти и внутриклеточных Ca2 + динамики3 . Изменения в митохондриальной функции были связаны с человека болезней, включая рак, сахарный диабет и различных нейродегенеративных заболеваний4,5. Увеличение митохондриальной дисфункции и митохондриальных мутаций ДНК также думал вносить нормального старения процессов6,,78. Таким образом контроль качества является ключевым вопросом в митохондриях. Митохондрии являются высокодинамичные органеллы, которые непрерывно можно изменить их форму между удлиненным сетей и короткие, раздробленной формой. Митохондрии динамики играет важную роль в поддержании функции митохондрий, а также их деградации через mitophagy9.
Mitophagy — это механизм, который включает селективного деградации всего митохондрий, с использованием механизма autophagy. Mitophagy является принцип механизма основной митохондриальную оборот и удаление поврежденных или неблагополучных митохондрий. В этом процессе митохондрии окружены сначала мембраны, что приводит к формированию autophagosomes, которые затем сливаются с лизосомы гидролитическая деградации9. Предыдущих генетические исследования в дрозофилы предложили что два генов, связанных с болезнью Паркинсона, PTEN-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) (PARK6) и Паркин (PARK2), функционировать в том же пути10,11. Самой длинной общей подпоследовательности исследования показали, что путь PINK1-Паркин отвечает за устранение повреждения митохондрий и дефектов в результате этот путь в неблагополучных mitophagy и может способствовать болезни человека12,13. Дефекты в mitophagy процессах были недавно найдены в различных человеческих заболеваний, включая рак, болезни сердца, заболевания печени и нейродегенеративные болезни 14. Кроме того недавние исследования также показали, что mitophagy имеет решающее значение для многих физиологических процессов, например дифференциация, развития и иммунный ответ15,16,17,18 ,19, предполагая, что mitophagy могут играть более активную роль в управлении функции клеток.
Несмотря на недавнее подтверждение, что mitophagy играет важную роль в обоих качества управления в митохондриях и болезней человека, лежащие в основе mitophagy молекулярные механизмы остаются плохо понимают. Хотя механизмы, связанные с mitophagy систематически исследованы в дрожжи, исследования, направленные на изучение механизмов, связанных с mitophagy, в клетках млекопитающих главным образом на PINK1-Паркин путь. Предыдущие исследования установили, что путь PINK1-Паркин отвечает главным образом за селективное удаление поврежденных митохондрий через mitophagy12,,2021. Однако недавние исследования сообщили, что в некоторых моделях, mitophagy может быть активирован даже в отсутствие функциональных PINK122,,23–24. Эти результаты показывают, что в дополнение к PINK1-Паркин путь, там еще неопознанных путь, который может активировать mitophagy.
Отсутствие удобного метода для оценки деятельности mitophagy является серьезным препятствием для изучения путей, которые регулируют mitophagy и его роль в патофизиологической событий. Электронная микроскопия является мощным инструментом непосредственно визуализировать охватил autophagosome митохондрий. Однако электронная микроскопия имеет ограничения в количественном определении mitophagy активность. Хотя стратегии, которые используют связанные микротрубочек белка-1 легкая цепь 3 (LC3)-конъюгированных флуоресцентных зондов, например GFP-LC3, в настоящее время наиболее широко используемых подходов25, преходящий характер на основе LC3 сигнала и его высокий уровень ложно положительных сигналов ограничивают его чувствительность обнаружения mitophagy в клетки26. Сочетание Западный blotting для измерения уровня митохондриальных белок, количественная оценка митохондриальной ДНК и анализ микроскопии флуоресцирования colocalize митохондрий с autophagosomes или лизосомы будет хорошим подходом для оценки mitophagy. Однако количественная оценка ограничений и отсутствия удобства существующих методологий требуют новых подходов. Введение новой рН зависимых флуоресцентный белок, митохондриальных целевой Keima (mt-Keima), значительно улучшить способность обнаруживать mitophagy27. Смешав последовательности митохондриальной ориентации цитохрома с-оксидазы субъединицы VIII (Кокс VIII) в Keima, mt-Keima направлена на митохондриальной матрицы. Большой сдвиг в пик возбуждения Keima от 440 Нм до 586 Нм (соответствует рН 7 и pH 4, соответственно) могут быть использованы для оценки mitophagy с хорошим чутко в как in vitro и in vivo эксперименты28,29 . Что еще более важно сопротивление МТ Keima лизосомальных деградации вызывает интеграции МТ Keima сигнала в лизосомы, позволяя легко количественного измерения активности mitophagy. Флуоресценции изменение, которое происходит в МТ Keima могут быть проанализированы с использованием либо конфокальная микроскопия поток или цитометрии28,29. Однако на основе цитометрии метод потока для определения mitophagy активности с использованием МТ Keima не обеспечивается в деталях на сегодняшний день.
Здесь мы описываем подробный протокол для потока на основе цитометрии техники для измерения mitophagy активность в клетках, использование МТ Keima. Хотя мы показали здесь, что cytometry анализ потока успешно обнаружен CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa, выражая Паркин, этот метод может быть применен к широкий спектр типов клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем быстрый и чувствительных метод использования проточной цитометрии для измерения активности клеточных mitophagy в клетках, выражая МТ Keima. Клетки, переживает высокий уровень mitophagy демонстрируют увеличение соотношения между объемом PE-CF594 (561 Нм) / BV605 (405 нм) возбуждения. Т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грант от Национальный исследовательский фонд Кореи (2016R1D1A1B03931949) (на ю. д.) и Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF) Грант, финансируемого Кореи government(MSIT) (№ 2016R1A2B2008887, № 2016R1A5A2007009) (для J.Y .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
