蛍光レポーターの pH 依存性を用いたフローサイトメトリー流 mt 桂馬によって Mitophagy の高感度測定
Summary
Mitophagy、ミトコンドリアの選択的分解はミトコンドリアの恒常性に関与しているし、様々 な疾患の緩和します。ただし、mitophagy 活性を測定する便利な実験方法は非常に限られました。ここでは、フローサイトメトリーを用いた mitophagy 活性を測定する敏感な試金を提供します。
Abstract
Mitophagy は、オートファジーの機械を使用して破損または不要なミトコンドリアの選択的除去のプロセスです。つながり不良 mitophagy と神経変性疾患、癌、代謝性疾患など、様々 な人間の病気の発見されています。さらに、最近の研究は、その mitophagy は、差別化と開発など、正常な細胞プロセスに関与しているを示しています。ただしの精密な役割と分子機構 mitophagy さらなる研究が必要です。したがって、mitophagy 活性の変化を測定するための堅牢な便利な方法を開発する重要です。ここでは、ミトコンドリアをターゲットとした蛍光タンパク質桂馬 (mt 桂馬) を用いたフローサイトメトリーによる mitophagy 活性を定量的に評価するための詳しいプロトコルについて述べる。この流れの cytometry の試金より迅速かつ従来顕微鏡または免疫ブロット ベースの方法よりも敏感に mitophagy アクティビティを分析できます。このプロトコルは、種々 の細胞の mitophagy 活動を分析に適用できます。
Introduction
ミトコンドリアは、細胞の増殖、生理学に不可欠な細胞内小器官です。ミトコンドリア酸化的リン酸化による ATP の供給の 80% 以上を生成するために責任があるし、また生合成・代謝1,2の様々 な代謝中間体を提供します。エネルギー供給と代謝における役割、に加えてミトコンドリアは、活性酸素種 (ROS) の生成、細胞死と細胞内 Ca2 +動態3 の規制を含め、他の多くの重要なプロセスで中心的な役割を再生します。.ミトコンドリアの機能の変化は、人間の病気、癌、糖尿病、様々 な神経変性疾患4,5などに関連付けられています。増加したミトコンドリアとミトコンドリア DNA の変異はまた正常な老化プロセス6,7、8に貢献すると思った。したがって、品質管理、ミトコンドリアの重要な問題です。ミトコンドリアは、細長い網と短い、断片化されたフォームの形状を変更することが継続的に非常に動的な細胞内小器官です。ミトコンドリアのダイナミクスは、mitophagy9を通して彼らの劣化と同様、ミトコンドリアの機能を維持する上で重要な役割を果たしています。
Mitophagy は、ミトコンドリア、オートファジーの機械を使用しての選択的分解を含むメカニズムです。Mitophagy は原則機構基礎となるミトコンドリア売り上げ高と損傷した、または機能不全のミトコンドリアの除去です。この過程でミトコンドリア最初オートファゴソームは、加水分解9リソソームと融合し、形成の結果、膜によって囲まれています。ショウジョウバエの遺伝学的研究の前は、2 つを示唆しているパーキンソン病関連遺伝子、PTEN による推定のキナーゼ 1 (PINK1) (PARK6)、同じ経路10,11ではパーキン (PARK2) 機能します。PINK1 パーキン経路はこの経路において機能不全 mitophagy の欠陥しひと疾患12,13に貢献するかもしれないこと、傷害ミトコンドリアの排除する責任が、サブシーケンス研究が示されています。Mitophagy プロセスの欠陥は、がん、心臓病、肝臓病、神経変性疾患14を含む様々 な人間の病気で最近発見されています。さらに、最近の研究はその mitophagy が分化、開発、および免疫応答15,16,17,18 などの多くの生理学的プロセスに重要を示しているも ,19, その mitophagy は細胞機能を制御することでより積極的な役割を果たすことを示唆しています。
Mitophagy ミトコンドリアの両方の品質管理に重要な役割を果たしているし、人間の病気、mitophagy の分子機構が不十分なまま最近の確認にもかかわらず理解されます。Mitophagy 関連の機構は酵母で体系的に研究されている、哺乳類細胞における mitophagy 関連メカニズムの探索を目的とした研究が主に PINK1 パーキン経路に焦点を。前の研究は PINK1 パーキン経路は mitophagy12,20,21を介して傷害ミトコンドリアの除去を主に担当を確立しました。しかし、最近の研究を一部のモデルで mitophagy を機能 PINK122,23,24の不在でも起動できるかを報告しています。これらの結果は PINK1 パーキン経路、そこ mitophagy をアクティブにすることができます追加の正体不明経路に加えてことをお勧めします。
Mitophagy 活動を評価するために便利な方法の不在は、mitophagy と病態生理学的イベントにおけるその役割を調節する経路を探索するための主要な障害です。電子顕微鏡は、オートファゴソームを巻き込んだミトコンドリアを直接可視化する強力なツールです。しかし、電子顕微鏡、mitophagy 活動の定量化における制限です。微小管関連タンパク質 1 を使用して、戦略ライト鎖 3 (LC3) が-、GFP LC3 などの共役蛍光プローブが現在最も広く使用されているアプローチ25、LC3 ベース信号の過渡的な性質とその率が高い偽陽性シグナルは、細胞26で mitophagy を検出する感度を制限します。ミトコンドリア蛋白質のレベル、オートファゴソームとリソソームのミトコンドリアを colocalize するミトコンドリア DNA と蛍光顕微鏡分析の定量化を測定する西部にしみが付く組み合わせが評価するための良い方法になります。mitophagy。ただし、数量制限と既存方法論の利便性の欠如は、新しいアプローチを求めます。新しい pH 依存性蛍光タンパク質、桂馬 (mt 桂馬), ミトコンドリアのターゲットの導入 mitophagy27を検出する能力が大幅改善。桂馬にシトクロム c 酸化酵素サブユニット VIII (コックス VIII) のミトコンドリア ターゲット シーケンスを融合することで mt 桂馬はミトコンドリアのマトリックスに送られます。440 から桂馬の励起ピークの大きなシフト 586 nm (と 4、pH 7 にそれぞれ対応する) ことができる nmの in vitroとin vivo実験28,29 で敏感に良い mitophagy を評価するために利用します。.もっと重要なは、ライソゾームの分解に mt 桂馬の抵抗 mitophagy 活動の簡単な定量的測定を可能にする、リソソームで mt 桂馬信号の統合が発生します。Mt 桂馬で発生した蛍光変更どちら共焦点の顕微鏡を使用して分析することができます。 またはフローサイトメトリー28,29の流れ。ただし、日付を詳しく流れ cytometry ベースの mt 桂馬を使用して mitophagy 活性を測定する方法が指定されていません。
ここでは、流れ cytometry ベースの mitophagy mt 桂馬を用いた細胞の活性を測定する手法のための詳しいプロトコルについて述べる。パーキンを発現 HeLa 細胞で正常に CCCP 誘起 mitophagy が検出されたように流れフローサイトメトリー解析我々 はここで示されているが、この手法はさまざまな種類の細胞に適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
フローサイトメトリーを使用して携帯電話 mitophagy mt 桂馬を発現する細胞の活動を測定するための迅速・高感度なメソッドを紹介します。Mitophagy の高レベルを経るセル展示 PE CF594 の増加率 (561 nm)/BV605 (405 nm) 励起。したがって、mitophagy の活動は、561/405 率を示す細胞の割合として表現できます。PE CF594 のドット プロット上の「高」のゲート領域内のセルの割合を計算した (561 nm) 対 BV605 (405 nm)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事を受けました (j. u.) に国立研究財団の韓国 (2016R1D1A1B03931949) からの助成金、韓国 (NRF) 助成金 (J.Y に韓国 government(MSIT) (第 2016R1A2B2008887、第 2016R1A5A2007009) によって資金を供給された研究財団.)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
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