قياس ميتوفاجي الحساسة بالتدفق الخلوي استخدام تعتمد على درجة الحموضة "مراسل الفلورسنت" طن متري-كيما
Summary
قد تورط في التوازن المتقدرية ميتوفاجي، تدهور انتقائية من الميتوكوندريا، وهو رفع الضوابط التنظيمية في مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. ومع ذلك، ملاءمة الأساليب التجريبية لقياس النشاط ميتوفاجي محدودة للغاية. هنا، نحن نقدم مقايسة حساسة لقياس نشاط ميتوفاجي باستخدام التدفق الخلوي.
Abstract
ميتوفاجي عملية إزالة انتقائية من الميتوكوندريا معطوب أو غير الضرورية باستخدام جهاز أوتوفاجي. وجدت روابط وثيقة بين ميتوفاجي المعيبة والأمراض البشرية المختلفة، بما في ذلك أمراض الأعصاب والسرطان والأمراض الأيضية. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن ميتوفاجي وتشارك في العمليات الخلوية العادية، مثل التمايز والتنمية. ومع ذلك، بدور محدد والآليات الجزيئية الكامنة وراء ميتوفاجي تتطلب مزيدا من الدراسة. ولذلك، من المهم لتطوير طريقة قوية وملائمة لقياس التغيرات في النشاط ميتوفاجي. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لتقييم كمي النشاط ميتوفاجي من خلال التدفق الخلوي استخدام البروتين الفلورسنت الميتوكوندريا التي تستهدف كيما (طن متري-كيما). ويمكن تحليل هذا الفحص الخلوي تدفق النشاط ميتوفاجي أكثر سرعة وحساسية من الأساليب التقليدية القائمة على الميكروسكوب أو إيمونوبلوتينج. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتحليل النشاط ميتوفاجي في مختلف أنواع الخلايا.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات التي تعتبر ضرورية لتكاثر الخلايا وعلم وظائف الأعضاء. الميتوكوندريا المسؤولة عن توليد أكثر من 80 في المائة إمدادات ATP عن طريق الفسفرة، وكما أنها توفر مختلف المواد الوسيطة الأيضية للتركيب الحيوي والاستقلاب1،2. بالإضافة إلى أدوارها في إمدادات الطاقة والايض، الميتوكوندريا تلعب أدواراً مركزية في العديد من العمليات الهامة الأخرى، بما في ذلك توليد الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية، وتنظيم موت الخلية وداخل الخلية Ca2 + ديناميات3 . وكانت التعديلات في الوظيفة المتقدرية المرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك السرطان والسكري وأمراض الأعصاب المختلفة4،5. كما يعتقد أن تسهم في الشيخوخة العادية العمليات6،،من78زيادة خلل mitochondrial وطفرات الحمض النووي mitochondrial. ولذلك، مراقبة الجودة مسألة حاسمة في الميتوكوندريا. الميتوكوندريا هي العضيات شديد الحيوية التي يمكن بشكل مستمر تغيير شكلها بين شبكات ممدود والنموذج القصير، مجزأة. ديناميات الميتوكوندريا دوراً هاما في الحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا، فضلا عن التدهور من خلال ميتوفاجي9.
ميتوفاجي هو إليه التي تنطوي على تدهور انتقائية الميتوكوندريا كاملة باستخدام جهاز أوتوفاجي. ميتوفاجي هو إليه المبدأ الأساسي معدل دوران mitochondrial وإزالة الميتوكوندريا التالفة أو مختلة. في هذه العملية، الميتوكوندريا أولاً يحيط بها غشاء، أسفر عن تشكيل أوتوفاجوسوميس، الذي ثم تلتحم مع lysosomes لتدهور هيدروليكي9. اقترحت الدراسات الوراثية السابقة في المورفولوجية أن اثنين الجينات المتعلقة بمرض باركنسون، والناجمة عن فتن كيناز المفترضة 1 (PINK1) (PARK6) وباركين (PARK2)، يعمل في نفس المسار10،11. وقد أظهرت الدراسات استأثر أن المسار باركين PINK1 هي المسؤولة عن القضاء على الميتوكوندريا التالفة والعيوب في هذه النتيجة الطريق في ميتوفاجي المختلة وظيفيا وقد تساهم في الأمراض البشرية12،13. مؤخرا وجدت عيوب في العمليات ميتوفاجي في الأمراض البشرية المختلفة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب، وأمراض الكبد و أمراض الأعصاب 14. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أيضا أن ميتوفاجي أمر بالغ الأهمية للعديد من العمليات الفسيولوجية، مثل التمايز، والتنمية، والاستجابة المناعية15،،من1617،18 ،19، مما يوحي بأن ميتوفاجي قد تلعب دوراً أكثر نشاطا في السيطرة على وظائف الخلية.
وعلى الرغم من تأكيد الأخيرة أن ميتوفاجي دوراً هاما في مراقبة الجودة على حد سواء في الميتوكوندريا والأمراض البشرية، الآليات الجزيئية الكامنة وراء ميتوفاجي تظل ضعيفة مفهومة. على الرغم من أن الآليات ذات الصلة ميتوفاجي وقد درست بشكل منهجي في الخميرة، ركزت دراسات تهدف إلى استكشاف الآليات ذات الصلة ميتوفاجي في خلايا الثدييات أساسا على المسار PINK1 باركين. وقد أنشأت الدراسات السابقة أن المسار باركين PINK1 مسؤولة في المقام الأول لإزالة انتقائية من الميتوكوندريا التالفة عن طريق ميتوفاجي12،،من2021. ومع ذلك، أفادت الدراسات الأخيرة أن في بعض النماذج، يمكن تنشيط ميتوفاجي حتى في غياب الوظيفية PINK122،،من2324. هذه النتائج تشير إلى أنه بالإضافة إلى المسار PINK1 باركين، هناك طريقا مجهولة إضافية يمكن تنشيط ميتوفاجي.
عدم وجود طريقة ملائمة لتقييم نشاط ميتوفاجي هو عقبة رئيسية أمام استكشاف المسارات التي تنظم ميتوفاجي ودورها في الأحداث الفيزيولوجية المرضية. المجهر الإلكتروني أداة قوية لتصور مباشرة اجتاحت أوتوفاجوسومي الميتوكوندريا. ومع ذلك، الميكروسكوب الإلكتروني على القيود في التحديد الكمي لنشاط ميتوفاجي. على الرغم من أن السلسلة 3 (LC3) الضوء على الاستراتيجيات التي تستخدم المرتبطة microtubule البروتين-1-مترافق المسابير الفلورية، مثل التجارة والنقل-LC3، حاليا25النهج الأكثر استخداماً، وطبيعة عابرة للإشارة على أساس LC3 وبه نسبة عالية من إشارات إيجابية كاذبة الحد من حساسية للكشف عن ميتوفاجي في خلايا26. مزيج من النشاف الغربية لقياس مستوى البروتين المتقدرية، التحديد الكمي للحمض النووي، والتحليل المجهري الأسفار كولوكاليزي الميتوكوندريا مع أوتوفاجوسوميس أو ليسوسوميس سيكون أسلوباً جيدا لتقييم ميتوفاجي. مع ذلك، استدعاء القيود الكمي وعدم الملاءمة للمنهجيات القائمة للنهج الجديد. الأخذ بروتين فلوري جديدة تعتمد على درجة الحموضة، الهدف المتقدرية كيما (طن متري-كيما)، تحسنت القدرة على الكشف عن ميتوفاجي27. بالصمامات تسلسل المتقدرية استهداف الفسفرة التأكسدية فرعية الثامن (كوكس الثامن) في كيما، توجه كيما طن متري للمصفوفة المتقدرية. التحول الكبير في ذروة الإثارة من كيما من 440 نانومتر إلى 586 نانومتر (المقابلة للرقم الهيدروجيني 7 والرقم الهيدروجيني 4، على التوالي) يمكن أن تستخدم لتقييم ميتوفاجي مع حسن حس مرهف في على حد سواء في المختبر و في فيفو تجارب28،29 . الأهم من ذلك، يسبب مقاومة كيما طن متري إلى تدهور الليزوزومية دمج الإشارات كيما طن متري في lysosomes، مما يسمح للقياس الكمي سهل النشاط ميتوفاجي. الأسفار والتغيير الذي يحدث في النقل المتعدد الوسائط-كيما يمكن تحليلها باستخدام أما مجهرية [كنفوكل] أو التدفق الخلوي28،29. ومع ذلك، قدمت لا تدفق الخلوي طريقة لقياس نشاط ميتوفاجي باستخدام النقل المتعدد الوسائط-كيما بالتفصيل لتاريخ.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لتقنية تستند إلى قياس تدفق لقياس النشاط ميتوفاجي في الخلايا باستخدام النقل المتعدد الوسائط-كيما. على الرغم من أننا أظهرنا هنا أن التدفق الخلوي التحليل بنجاح الكشف عن ميتوفاجي ااحد المستحثة في خلايا هيلا معربا عن باركين، يمكن تطبيق هذا الأسلوب على مجموعة متنوعة واسعة من أنواع الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا، طريقة سريعة وحساسة لاستخدام التدفق الخلوي لقياس النشاط ميتوفاجي الخلوية في الخلايا معربا عن كيما طن متري. يحمل الخلايا تمر بمستوى عال من ميتوفاجي زيادة نسبة PE-CF594 (561 nm)/BV605 (405 nm) الإثارة. وهكذا، يمكن التعبير عن نشاط ميتوفاجي بالنسبة المئوية للخلايا العارضة ارتفاع نسبة 561/405. قمنا بح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنحه من “مؤسسة أبحاث كوريا الوطنية” (2016R1D1A1B03931949) (لشين ياء)، ومؤسسة “البحوث الوطنية” في كوريا (جبهة الخلاص الوطني) منحة ممولة من government(MSIT) كوريا (رقم 2016R1A2B2008887 ورقم 2016R1A5A2007009) (إلى J.Y .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
