pH 依赖性荧光 Keima 对流式细胞术 Mitophagy 的敏感性测定

Summary

Mitophagy, 线粒体的选择性降解, 与线粒体稳态有关, 在各种人类疾病中被解除管制。然而, 方便的实验方法测量 mitophagy 活动是非常有限的。在这里, 我们提供了一个敏感的检测 mitophagy 活动使用流式细胞仪。

Abstract

Mitophagy 是一种选择性去除受损或不必要的线粒体使用自噬机械的过程。有缺陷的 mitophagy 和各种人类疾病 (包括神经退行性疾病、癌症和代谢性疾病) 之间存在着密切的联系。此外, 最近的研究表明, mitophagy 参与正常的细胞过程, 如分化和发展。然而, mitophagy 的确切作用和分子机制需要进一步研究。因此, 建立一种稳健、方便的测量 mitophagy 活动变化的方法至关重要。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以定量评估 mitophagy 活动, 通过流式细胞术使用线粒体靶向荧光蛋白 Keima (mt-Keima)。这种流式细胞仪可以比常规显微术或免疫印迹法方法更快速、灵敏地分析 mitophagy 活动。该协议可应用于分析各种细胞类型中的 mitophagy 活动。

Introduction

线粒体是细胞增殖和生理的基本器官。线粒体负责产生超过80% 的 ATP 供应通过氧化磷酸化, 他们也提供了各种代谢中间体的生物合成和新陈代谢^1,2。除了它们在能源供应和新陈代谢中的作用, 线粒体在许多其他重要过程中扮演中心角色, 包括活性氧 (ROS) 生成、细胞死亡调节和胞内 Ca^{2 +}动力学³.线粒体功能的改变与人类疾病有关, 包括癌症、糖尿病和各种神经退行性疾病^4、5。增加的线粒体功能障碍和线粒体 DNA 突变也被认为有助于正常衰老过程^6,7,8。因此, 质量控制是线粒体中的一个关键问题。线粒体是高度动态的细胞器, 可以在拉长的网络和短而零碎的形态之间不断改变它们的形状。线粒体动力学在维持线粒体功能以及通过 mitophagy⁹的降解过程中起着重要的作用。

Mitophagy 是一种机制, 它涉及利用自噬机械对整个线粒体进行选择性降解。Mitophagy 是线粒体更替和去除受损或功能失调的线粒体的原理机制。在这个过程中, 线粒体首先被膜包围, 导致自噬体的形成, 然后与溶酶体融合水解降解⁹。以往果蝇的基因研究表明, 两种帕金森病相关基因, PTEN 诱导的激酶 1 (PINK1) (PARK6) 和 PARK2, 功能在同一途径^10,11。子序列研究表明, PINK1-Parkin 通路是负责消除受损的线粒体和缺陷的这一途径导致功能失调的 mitophagy, 可能导致人类疾病^12,13。最近在各种人类疾病中发现了 mitophagy 过程的缺陷, 包括癌症、心脏病、肝病和神经退行性疾病¹⁴。此外, 最近的研究也表明, mitophagy 是关键的许多生理过程, 如分化, 发展和免疫反应^{15,16,17,18 ,19}, 表明 mitophagy 可能在控制细胞功能方面发挥更积极的作用。

尽管最近证实 mitophagy 在线粒体和人类疾病的质量控制中起着重要作用, 但 mitophagy 的分子机制仍然不太清楚。虽然在酵母中系统地研究了 mitophagy 相关的机制, 但旨在探索哺乳动物细胞 mitophagy 相关机制的研究主要集中在 PINK1-Parkin 途径上。以前的研究已经证实, PINK1-Parkin 途径主要负责选择性地去除受损的线粒体通过 mitophagy^12,20,21。然而, 最近的研究报告说, 在某些模型中, 即使在没有功能 PINK1^22、23、24的情况下, mitophagy 也可以被激活。这些结果表明, 除了 PINK1-Parkin 通路, 有一个额外的不明途径, 可以激活 mitophagy。

缺乏一种方便的评估 mitophagy 活动的方法是探索调节 mitophagy 及其在病理生理事件中作用的途径的主要障碍。电子显微术是直接可视化 autophagosome 吞噬的线粒体的有力工具。然而, 电子显微镜在量化 mitophagy 活动方面有局限性。虽然使用微管相关的 protein-1 光链 3 (LC3)-共轭荧光探针 (如 GFP-LC3) 的策略是目前应用最广泛的方法²⁵, LC3-based 信号的瞬态性及其高速率假阳性信号限制了其检测²⁶细胞 mitophagy 的灵敏度。结合西方印迹测量线粒体蛋白水平, 线粒体 DNA 的量化, 和荧光显微分析 colocalize 线粒体与自噬体或溶酶体将是一个很好的方法来评估mitophagy。然而, 量化限制和现有方法的缺乏方便要求采取新的办法。引入一种新的 pH 依赖性荧光蛋白, 线粒体靶 Keima (mt-Keima), 大大提高了检测 mitophagy²⁷的能力。将细胞色素 c 氧化酶亚基 viii (COX viii) 的线粒体靶向序列融合成 Keima, Keima 被定向到线粒体基质。Keima 的励磁峰的大位移从440毫微米到 586 nm (分别对应于 ph 7 和 ph 4) 可以用来评估 mitophagy在体外和体内实验^28,29.更重要的是, Keima 对溶酶体降解的抗性导致了 Keima 信号在溶体蛋白中的整合, 使得 mitophagy 活性的定量测量变得容易。在 Keima 中发生的荧光变化可以用共焦显微镜或流式细胞术^28,29进行分析。然而, 目前还没有详细提供基于流式细胞仪的测量 mitophagy 活动的方法–Keima。

在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以流式细胞术为基础的技术, 以测量细胞 mitophagy 活动, 使用 mt-Keima。虽然我们在这里表明, 流式细胞术分析成功地检测到 CCCP 诱导 mitophagy 在 HeLa 细胞表达, 这一技术可以应用于多种细胞类型。

Protocol

1. 表达 Keima (mt-Keima) 的 HeLa 细胞的生成 Keima 慢病毒北疆的制备 用2毫升0.001% 聚 l-赖氨酸/磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 涂上100毫米的培养基, 在室温下可以站立5分钟。 使用连接到真空的玻璃吸管去除聚 l-赖氨酸溶液, 并通过添加2毫升 1x PBS 来洗涤培养皿。 板 1.5 x 106 HEK293T 细胞在涂层培养皿与10毫升的 DMEM 含有10% 的血清和1% 青霉素/链霉素, 并培养细胞在…

Representative Results

如图 4所示, CCCP 诱导的 mitophagy 细胞的流式细胞术分析。应用上述流式细胞仪分析方法, 可以检测出 “高” 门 mitophagic 细胞的急剧增加。与未经处理的控制细胞相比, “高” 门细胞的百分比增加了10倍以上 (图 4A)。mitophagy 活动的增加完全被取消了与 bafilomycin A (论坛) 的合作 (图 4A和4B)。 <p class="jo…

Discussion

在这里, 我们提出了一个快速和灵敏的方法, 使用流式细胞仪来测量细胞 mitophagy 活动在表达 mt Keima。接受高水平 mitophagy 的细胞表现为 PE-CF594 (561 nm)/BV605 (405 nm) 激发的比例增加。因此, mitophagy 活动可以表示为高561/405 比例的细胞百分比。我们计算了 PE-CF594 (561 nm) 与 BV605 (405 nm) 的斑点图中 “高” 门区域内细胞的百分比, 结果表明 CCCP 的治疗导致了 HeLa 细胞 mitophagy 的增加。我们以前证明, 慢病毒北疆?…

Materials

REAGENTS
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
penicillin/streptomycin	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermos scientific	R0531
0.45 μm syringe filter	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromycin	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
trypsin-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)