מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima
Summary
Mitophagy, השפלה סלקטיבי של המיטוכונדריה, היה מעורב הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי, הוא deregulated למחלות אנושיות שונות. עם זאת, שיטות נסיוניות נוח למדידת פעילות mitophagy מוגבלים מאוד. כאן, אנו מספקים וזמינותו רגיש למדידת פעילות mitophagy באמצעות cytometry זרימה.
Abstract
Mitophagy הוא תהליך של הסרת סלקטיבי של המיטוכונדריה פגום או לא נחוץ שימוש autophagy מכונות. נמצאו קשרים הדוקים בין mitophagy פגומים מחלות אנושיות שונות, כולל מחלות ניווניות, סרטן ומחלות מטבוליות. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-mitophagy הזה מעורב בתהליכי סלולרית רגילה, כמו התמיינות והתפתחות. עם זאת, התפקיד המדויק של המנגנונים המולקולריים שבבסיס mitophagy דורשים לימוד נוסף. לכן, חיוני לפתח שיטה חזקה ונוחה למדידת השינויים בפעילות mitophagy. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורטת להערכת באופן כמותי mitophagy פעילות דרך cytometry זרימה באמצעות החלבון הניאון, ממוקדות המיטוכונדריה Keima (mt-Keima). זה וזמינותו cytometry זרימה ניתן לנתח פעילות mitophagy יותר במהירות וברגישות מאשר קונבנציונאלי מיקרוסקופ או immunoblotting מבוססת על שיטות. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי לנתח פעילות mitophagy סוגי תאים שונים.
Introduction
המיטוכונדריה הם organelles כי הם חיוניים עבור התפשטות תאים ופיזיולוגיה. המיטוכונדריה הם אחראי על יצירת יותר מ 80% מאספקת ATP באמצעות זרחון חמצוני, הם גם מספקים ביניים מטבוליים שונים עבור ביוסינטזה ואת חילוף החומרים1,2. בנוסף לתפקידים שלהם אספקת אנרגיה, מטבוליזם, המיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרכזי בתהליכים רבים אחרים חשובים, כולל דור (ROS) מינים חמצן תגובתי, ברגולציה של מוות של תאים, Ca תאיים2 + דינמיקה3 . שינויים בתפקוד מיטוכונדריאלי קושרו עם מחלות אנושיות, לרבות סרטן, סוכרת,4,מחלות ניווניות שונות5. תפקוד מיטוכונדריאלי מוגברת, מוטציות דנ א מיטוכונדריאלי נחשבים גם לתרום הזדקנות נורמלית תהליכים6,7,8. לכן, בקרת איכות הוא עניין מכריע בתוך המיטוכונדריה. המיטוכונדריה הם organelles דינמי מאוד ללא הרף שיכולים לשנות את צורתם בין רשתות מוארך טופס קצר, מפוצלים. המיטוכונדריה dynamics ממלא תפקיד חשוב בשמירה על הפונקציה של המיטוכונדריה, כמו גם שפלותם עד mitophagy9.
Mitophagy הוא מנגנון זה כרוך השפלה סלקטיבי של המיטוכונדריה שלם באמצעות המנגנון autophagy. Mitophagy הוא עקרון המנגנון הבסיסי מחזור מיטוכונדריאלי והסרה של המיטוכונדריה פגום או לא מתפקדת. בתהליך זה, המיטוכונדריה קודם מוקף קרום, וכתוצאה מכך להיווצרות של autophagosomes, אשר אז נתיך עם lysosomes השפלה hydrolytic9. מחקרים גנטיים הקודם בדרוזופילה הראו ששני גנים הקשורים מחלת פרקינסון, הנוצרות על-ידי PTEN בשם קינאז 1 (PINK1) (PARK6) פרקין (PARK2), לתפקד באותו מסלול10,11. תת-סדרה מחקרים הראו כי מסלול PINK1-פרקין האחראית לסילוק המיטוכונדריה פגום מפגמים תוצאה זו מסלול ב mitophagy לא מתפקדת, עשוי לתרום מחלות אנושיות12,13. פגמים בתהליכים mitophagy לאחרונה התגלו מחלות אנושיות שונות, כולל סרטן, מחלות לב, מחלות כבד, מחלות ניווניות 14. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה גם הראו שכי mitophagy הינה קריטית תהליכים פיזיולוגיים רבים, כגון בידול, התפתחות התגובה החיסונית15,16,17,18 ,19, רומז mitophagy זה עשוי לשחק תפקיד פעיל יותר פונקציות תא השליטה.
למרות אישור האחרונות כי mitophagy ממלא תפקיד חשוב בבקרת איכות שני בתוך המיטוכונדריה, מחלות אנושיות, המנגנונים המולקולריים שבבסיס mitophagy נשארים לקוי הבין. למרות מנגנונים הקשורים mitophagy נחקרו באופן שיטתי של שמרים, מחקרים שמטרתם לחקור מנגנונים הקשורים mitophagy בתאים בתרבית של התמקדו בעיקר המעבר PINK1-פרקין. מחקרים קודמים הקימו המעבר PINK1-פרקין אחראי בעיקר על הסרת סלקטיבי של המיטוכונדריה פגום באמצעות mitophagy12,20,21. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו כי כמה דגמים, mitophagy יכול להיות מופעל גם בהיעדר פונקציונלי PINK122,23,24. תוצאות אלו מעידות על כך בנוסף מסלול PINK1-פרקין, שם מסלול לא מזוהה נוספים לבצע הפעלה mitophagy
העדר של שיטה נוחה כדי להעריך mitophagy פעילות זו היא מכשול גדול כדי לחקור את המסלולים המסדירים mitophagy ותפקידו באירועים הקשורים pathophysiological. מיקרוסקופ אלקטרונים הוא כלי רב עוצמה ישירות להמחיש המיטוכונדריה שפוקדת autophagosome. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרונים יש מגבלות לכימות mitophagy פעילות. למרות אסטרטגיות המשתמשות הקשורים microtubule חלבון-1 אור שרשרת 3 (LC3)-הגששים פלורסנט מצומדת, כגון ה-GFP-LC3, הם כיום גישות הנפוצה ביותר25, הארעיות של האות מבוסס-LC3 ועבור הקצב גבוה של חיובי-false אותות להגביל את הרגישות שלה לגילוי mitophagy תאים26. שילוב של סופג המערבי כדי למדוד את רמת חלבון מיטוכונדריאלי, כימות של דנ א מיטוכונדריאלי, וניתוח פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי colocalize המיטוכונדריה עם autophagosomes או lysosomes תהיה גישה טובה להערכת mitophagy. עם זאת, מגבלות כימות וחוסר הנוחות של מתודולוגיות קיימות להזעיק גישות חדשות. המבוא של חלבון פלואורסצנטי חדש תלויי-pH, המטרה מיטוכונדריאלי Keima (mt-Keima), לשפר באופן משמעותי את היכולת לזהות mitophagy27. על ידי מיזוג הרצף מיטוכונדריאלי פילוח של ציטוכרום c אוקסידאז מיתרים יחידה משנית השמיני (קוקס השמיני) לתוך Keima, mt-Keima מכוונת אל המטריקס מיטוכונדריאלי. משמרת גדול בשיא עירור של Keima מ- 440 ננומטר עד 586 nm (תואם ל- pH 7 ו- pH 4, בהתאמה) יכול להיות מנוצל כדי להעריך mitophagy עם הטוב ברגישות גם במבחנה וגם ויוו ניסויים28,29 . חשוב מכך, ההתנגדות של mt-Keima כדי השפלה lysosomal גורמת השילוב של האות mt-Keima lysosomes, המאפשר למדידה כמותית קל של פעילות mitophagy. השינוי פלורסצנטיות המתרחשת ב- mt-Keima ניתן לנתח באמצעות גם מיקרוסקופיה קונפוקלית או לזרום cytometry28,29. עם זאת, שיטה המבוססת על cytometry זרימה למדידת פעילות mitophagy באמצעות mt-Keima לא סופק בפירוט עד כה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור טכניקה המבוססת על cytometry זרימה למדידת פעילות mitophagy בתאים באמצעות mt-Keima. למרות שהראתי כאן כי ניתוח cytometry זרימה זוהה בהצלחה mitophagy CCCP-induced בתאים הלה לבטא פרקין, ניתן ליישם טכניקה זו מגוון רחב של סוגי תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ורגיש באמצעות מיכשור למדידת פעילות הסלולר mitophagy בתאים המבטאים mt-Keima. תאים שעברו רמה גבוהה של mitophagy שהפגינו יחס מוגבר של PE-CF594 (561 ננומטר) / BV605 (405 ננומטר) עירור. לפיכך, ניתן לבטא פעילות mitophagy אחוז תאים מפגין יחס 561/405 גבוה. לנו לחשב את אחוז תאים באזור שער ‘גבוהה’ על מגרש נק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק הלאומי מחקר קרן של קוריאה (2016R1D1A1B03931949) (י א), ועל ידי קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט במימון government(MSIT) קוריאה (2016R1A2B2008887 מס, מס 2016R1A5A2007009) (כדי J.Y .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
