Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından
Summary
Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.
Abstract
Mitophagy seçici autophagy makine kullanarak hasarlı ya da gereksiz mitokondri kaldırılması işlemidir. Yakın bağları arızalı mitophagy ve nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları arasında bulunmuştur. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu mitophagy normal hücresel süreçler, başkalaşım ve gelişimi gibi ilgilenmektedir göstermiştir. Ancak, kesin rolü ve moleküler mekanizmaları mitophagy altında yatan daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, bu değişiklikler mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlam ve uygun bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Burada, mitophagy etkinlik mitokondri hedefli floresan protein Keima (mt-Keima) kullanarak akış sitometresi ile kantitatif değerlendirilmesi için detaylı bir protokol açıklayın. Bu akış sitometresi tahlil daha hızlı ve hassas Yöntemler konvansiyonel mikroskopi veya immunoblotting göre daha mitophagy etkinliğini çözümleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı çeşitli hücre tiplerinin mitophagy etkinliğini çözümlemeye uygulanabilir.
Introduction
Mitokondri hücre çoğalması ve Fizyoloji için gerekli olan organelleri vardır. Mitokondri ATP tedarik Oksidatif fosforilasyon üzerinden % 80’den fazla oluşturmaktan sorumlu vardır ve onlar da biyosentezi ve metabolizma1,2için çeşitli metabolik ara ürün sağlamak. Enerji arzı ve metabolizma rolleri yanı sıra, mitokondri reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, hücre ölümü ve intrasellüler Ca2 + dynamics3 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok diğer önemli süreçlerinde, merkezi rol oynarlar . Mitokondriyal işlevde değişiklik kanser, diyabet ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar4,5de dahil olmak üzere insan hastalıkları ile ilişkili bulunmuştur. Artan mitokondrial disfonksiyon ve mitokondriyal DNA mutasyonlar da normal yaşlanma süreçlerini6,7,8‘ e katkıda düşünülmektedir. Bu nedenle, kalite kontrol mitokondri içinde çok önemli bir konudur. Mitokondri sürekli uzun ağlar ve kısa, parçalanmış bir form arasında kendi şeklini değiştirebilirsiniz son derece dinamik organelleri vardır. Mitokondri dynamics mitokondri yanı sıra onların yıkımı ile mitophagy9fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar.
Mitophagy bütün mitokondri autophagy makine kullanarak Seçmeli bozulma içerir bir mekanizmadır. Mitophagy ilke mekanizması temel mitokondrial ciro ve zarar görmüş veya işlevsiz mitokondri kaldırılması olduğunu. Bu süreçte, mitokondri ilk organellerin hydrolytic Bozulması9ile sigorta autophagosomes oluşumu sonuçlanan bir zar çevrilidir. Önceki genetik çalışmalarda Drosophila iki önerilen Parkinson hastalığı ile ilgili genleri, sözde kinaz PTEN kaynaklı 1 (PINK1) (PARK6) ve Parkin (PARK2), aynı yolu10,11‘ işlev. Strüktür çalışmaları PINK1-Parkin yolu bozuk mitokondri ortadan kaldırılması için sorumludur ve işlevsel olmayan mitophagy bu yolu sonuç kusurları ve insan hastalıkları12,13için katkıda bulunabilir göstermiştir. Hatalarına mitophagy süreçlerde son zamanlarda çeşitli insan hastalıkları, kanser, kalp hastalığı, karaciğer hastalıkları ve nörodejeneratif hastalık 14gibi bulduk. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu mitophagy ayırt etme, geliştirme ve bağışıklık yanıtı15,16,17,18 gibi birçok fizyolojik süreçleri için çok önemlidir göstermiştir ,19o mitophagy hücre fonksiyonları kontrol daha aktif bir rol oynamak düşündüren,.
Mitophagy mitokondri her iki kalite kontrol önemli bir rol oynar ve insan hastalık, mitophagy temel moleküler mekanizmaları kalır kötü son onay rağmen anladım. Her ne kadar mitophagy ile ilgili mekanizmalar sistematik olarak Maya incelenmiştir, mitophagy ile ilgili mekanizmalar memeli hücrelerinde keşfetmek yönelik çalışmaları esas olarak PINK1-Parkin yolu üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar PINK1-Parkin yolu öncelikle mitophagy12,20,21üzerinden hasarlı mitokondri seçici kaldırılması için sorumludur kurduk. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bazı modelleri mitophagy fonksiyonel PINK122,23,24olmadığında da etkinleştirilebilmesi için bildirdin. Bu sonuçlar PINK1-Parkin yolu ek olarak, orada mitophagy etkinleştirebilirsiniz ek bir tanımlanamayan yolu göstermektedir.
Mitophagy etkinliğini değerlendirmek için uygun bir yöntem mitophagy ve patofizyolojik olaylarda rolü düzenleyen yollar keşfetmek için büyük bir engel bulunmamasıdır. Elektron mikroskobu doğrudan autophagosome yuttu mitokondri görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Ancak, elektron mikroskobu mitophagy aktivite miktarının içinde sınırlamalar vardır. Her ne kadar Mikrotubul ilişkili protein-1 kullanmak stratejileri zinciri 3 (LC3) ışık-GFP-LC3 gibi konjuge floresan problar vardır şu anda en çok kullanılan yaklaşımlar25, LC3 tabanlı sinyal geçici doğasını ve onun yüksek oranda yanlış sinyalleri mitophagy hücreleri26algılama hassasiyeti sınırlayın. Mitokondrial protein seviyesi, Mitokondrial DNA ve floresan mikroskopi analiz mitokondri ya autophagosomes ya da organellerin ile colocalize için miktar ölçmek için western Blot bir arada değerlendirmek için iyi bir yaklaşım olurdu mitophagy. Ancak, miktar kısıtlamaları ve uygunluk-in mevcut metodolojiler eksikliği yeni yaklaşımlar için çağrı. Giriş bir yeni pH bağımlı floresan protein, mitokondrial hedef Keima (mt-Keima), mitophagy27algılama yeteneğini büyük ölçüde geliştirilmiş. Sitokrom c oksidaz alt birim VIII (COX VIII) Keima içine mitokondrial hedefleme dizisi eritme tarafından mt-Keima mitokondrial matris yönlendirilir. 440 büyük vardiya Keima uyarma tepe içinde nm 586 (pH 7 ve pH 4, sırasıyla karşılık) nm olabilir kullanılan hassas in vitro ve in vivo deneyler28,29 iyilikle mitophagy değerlendirmek için . Daha da önemlisi, mt-Keima lizozomal bozulması için direnç organellerin mitophagy aktivite kolay nicel ölçüm için izin, mt-Keima sinyal entegrasyonu neden olur. Mt-Keima içinde oluşur floresans değişikliği her iki confocal mikroskobu kullanılarak analiz veya akış sitometresi28,29. Ancak, mt-Keima kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı yöntemi ayrıntılı tarihi için sağlanmış olan değil.
Burada, mt-Keima kullanarak hücreleri mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı tekniği için detaylı bir protokol açıklayın. Her ne kadar biz burada Akış Sitometresi Analizi HeLa hücreleri Parkin ifade başarıyla CCCP kaynaklı mitophagy tespit göstermiştir, bu teknik çok çeşitli hücre tipleri için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, mt-Keima ifade hücreleri hücresel mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi kullanmanın hızlı ve hassas yöntemi mevcut. Mitophagy yüksek düzeyde geçiren hücreleri sergi PE-CF594 artan bir oranını (561 nm) / BV605 (405 nm) uyarma. Böylece, mitophagy etkinlik 561/405 oranı yüksek sergilenmesi hücre yüzdesi olarak ifade edilebilir. PE-CF594 bir nokta arsa üzerinde “yüksek” kapısı bölgesinde hücre yüzdesi hesaplanan (561 nm) BV605 karşı (405 nm), ve CCCP ile tedavi mitophagy H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser (J. U. için) Ulusal Araştırma Vakfı Kore’den (2016R1D1A1B03931949), bir hibe ve Kore (NMG) hibe (için J.Y Kore government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
