Mesure sensible des Mitophagy par Flow Cytometry à l’aide de la fonction du pH Fluorescent journaliste mt-Keima
Summary
Mitophagy, la dégradation sélective des mitochondries, a été impliquée dans l’homéostasie mitochondriale et est déréglementé dans diverses maladies humaines. Cependant, les méthodes expérimentales commodes pour mesurer l’activité de mitophagy sont très limitées. Ici, nous fournissons une analyse sensible pour mesurer l’activité mitophagy à l’aide de cytométrie en flux.
Abstract
Mitophagy est un processus d’élimination sélective des mitochondries endommagés ou inutiles à l’aide de machines de l’autophagie. Des liens étroits ont été trouvés entre mitophagy défectueux et diverses maladies humaines, y compris les maladies neurodégénératives, le cancer et les maladies métaboliques. En outre, des études récentes ont montré que mitophagy est impliqué dans les processus cellulaires normaux, tels que la différenciation et le développement. Cependant, le rôle précis des et des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les mitophagy nécessitent une étude plus approfondie. Par conséquent, il est essentiel d’élaborer une méthode robuste et pratique pour mesurer les changements dans l’activité mitophagy. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour évaluer quantitativement l’activité mitophagy par cytométrie de flux à l’aide de la protéine fluorescente axés sur les mitochondries Keima (mt-Keima). Ce dosage de cytométrie de flux peut analyser l’activité de mitophagy plus rapidement et plus sensible que les méthodes conventionnelles microscopie ou immunoblotting dotés. Ce protocole peut être appliqué pour analyser l’activité mitophagy dans divers types de cellules.
Introduction
Les mitochondries sont des organites qui sont essentiels pour la physiologie et la prolifération cellulaire. Les mitochondries sont chargés de générer plus de 80 % de l’approvisionnement en ATP par phosphorylation oxydative, et elles offrent aussi des intermédiaires métaboliques divers biosynthèse et métabolisme1,2. En plus de leur rôle dans l’approvisionnement énergétique et le métabolisme, les mitochondries jouent un rôle central dans de nombreux autres processus importants, y compris génération de réactives de l’oxygène (DRO), la régulation de la mort cellulaire et intracellulaire Ca2 + dynamique3 . Altérations de la fonction mitochondriale ont été associées à des maladies humaines, y compris le cancer, le diabète sucré et divers neurodégénératives maladies4,5. Une augmentation dysfonctionnement mitochondrial et les mutations de l’ADN mitochondriales semblent également contribuer au processus de vieillissement normal6,7,8. Par conséquent, le contrôle de la qualité est un enjeu crucial dans les mitochondries. Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui peuvent changer en permanence de leur forme entre réseaux allongées et forme courte et fragmentée. Dynamique des mitochondries joue un rôle important dans le maintien de la fonction des mitochondries ainsi que leur dégradation par l’intermédiaire de mitophagy9.
Mitophagy est un mécanisme qui implique la dégradation sélective des mitochondries entières en utilisant le mécanisme de l’autophagie. Mitophagy est le principe mécanisme sous-jacent mitochondrial chiffre d’affaires et de l’élimination des mitochondries endommagés ou dysfonctionnels. Dans ce processus, les mitochondries sont tout d’abord enveloppés d’une membrane, entraînant la formation des autophagosomes, qui puis fusionnent avec les lysosomes pour dégradation hydrolytique9. Des études génétiques antérieures chez la drosophile ont suggéré que deux gènes liés à la maladie de Parkinson, induite par le gène PTEN putatif kinase 1 (PINK1) (PARK6) et Parkin (PARK2), fonctionne sur la même voie10,11. Sous-suite ont démontré que la voie PINK1-Parkin est responsable de l’élimination des mitochondries endommagés et défauts de ce résultat de voie en mitophagy dysfonctionnel et peut-être contribuer à des maladies humaines12,13. Défauts dans les processus de mitophagy ont été récemment trouvés dans diverses maladies humaines, y compris le cancer, maladies cardiaques, maladies du foie et de maladies neurodégénératives 14. En outre, des études récentes ont également montré que mitophagy est essentiel pour de nombreux processus physiologiques, tels que la différenciation, le développement et la réponse immunitaire15,16,17,18 ,19, ce qui laisse supposer que mitophagy peut jouer un rôle plus actif dans le contrôle des fonctions cellulaires.
Malgré la confirmation récente que mitophagy joue un rôle important dans les deux contrôle de la qualité dans les mitochondries et les maladies humaines, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les mitophagy restent mal compris. Bien que les mécanismes axés sur les mitophagy ont été systématiquement étudiés chez les levures, études qui visent à explorer les mécanismes axés sur les mitophagy dans les cellules de mammifères portent principalement sur la voie de PINK1-Parkin. Des études antérieures ont démontré que la voie PINK1-Parkin est principalement responsable de l’élimination sélective des mitochondries endommagés via mitophagy12,20,21. Cependant, des études récentes ont rapporté que dans certains modèles, mitophagy peut être activé même en l’absence de fonctionnelle PINK122,23,24. Ces résultats suggèrent que, outre la voie PINK1-Parkin, là une voie non identifiée supplémentaire qui permet d’activer mitophagy.
L’absence d’une méthode pratique pour évaluer l’activité mitophagy est un obstacle majeur à explorer les voies qui régulent le mitophagy et son rôle dans les manifestations physiopathologiques. Microscopie électronique est un outil puissant pour visualiser directement les mitochondries autophagosome-englouti. Toutefois, la microscopie électronique a ses limites dans la quantification de l’activité mitophagy. Bien que les stratégies qui utilisent le microtubule-associated protein-1 chaîne 3 (LC3) légère-conjugués des sondes fluorescentes, comme GFP-LC3, sont actuellement les approches les plus largement utilisées25, la nature transitoire du signal basé sur LC3 et son taux élevé de signaux de faux-positifs limitent sa sensibilité pour la détection des mitophagy dans les cellules26. Une combinaison de western blot permettant de mesurer le niveau de protéines mitochondriales, la quantification de l’ADN mitochondrial et analyse de la microscopie de fluorescence sont colocalisées mitochondries avec autophagosomes ou lysosomes serait une bonne approche pour l’évaluation mitophagy. Toutefois, les limites de quantification et le manque de commodité des méthodologies existantes appellent de nouvelles approches. L’introduction d’une nouvelle protéine fluorescente dépend du pH, la cible mitochondriale Keima (mt-Keima), a grandement amélioré la capacité de détecter mitophagy27. En fusionnant la séquence de ciblage mitochondrial de sous-unité du cytochrome c oxydase (COX VIII), VIII, dans Keima, mt-Keima est dirigée vers la matrice mitochondriale. Le grand changement dans le pic de Keima de l’excitation de 440 nm à 586 nm (correspondant au pH de 7 et 4, respectivement) peut servir à évaluer les mitophagy avec un bon avec sensibilité à la fois in vitro et in vivo expériences28,29 . Plus important encore, la résistance du mt-Keima à la dégradation lysosomiale entraîne l’intégration du signal mt-Keima dans les lysosomes, permettant une simple mesure quantitative de l’activité mitophagy. Le changement de fluorescence qui survient chez mt-Keima peut être analysé en utilisant soit la microscopie confocale ou écoulement cytometry28,29. Toutefois, une méthode axée sur la cytométrie de flux pour mesurer l’activité mitophagy à l’aide de mt-Keima n’a pas été fournie avec précision jusqu’à présent.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour une technique axée sur la cytométrie de flux pour mesurer l’activité mitophagy dans les cellules à l’aide de mt-Keima. Bien que nous avons montré ici, que les analyse en cytométrie en flux détecté avec succès mitophagy induite par le CCCP dans les cellules HeLa exprimant Parkin, cette technique peut être appliquée à une grande variété de types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici une méthode rapide et sensible pour cytométrie pour mesurer l’activité de la mitophagy cellulaire dans les cellules exprimant mt-Keima. Les cellules subissant un niveau élevé de mitophagy montrent une augmentation du rapport du PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitation. Ainsi, mitophagy activité peut être exprimée comme le pourcentage de cellules présentant un taux élevé de 561/405. Nous avons calculé le pourcentage de cellules dans la région de la « haute » porte sur un terrai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de la recherche nationale de Corée (2016R1D1A1B03931949) (à J. U.) et par la Fondation de recherche National de Corée (NRF) subvention financée par le government(MSIT) de Corée (no 2016R1A2B2008887, no 2016R1A5A2007009) (à Jean-Yves .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
