Känsliga mätningar av Mitophagy av flödescytometri Flow och använda den pH-beroende fluorescerande Reporter mt-Keima
Summary
Mitophagy, selektiv nedbrytning av mitokondrier, har varit inblandad i mitokondriell homeostas och är avreglerade i olika mänskliga sjukdomar. Bekväm experimentella metoder för att mäta mitophagy aktivitet är dock mycket begränsade. Här ger vi en känslig analys för att mäta mitophagy aktivitet med hjälp av flödescytometri.
Abstract
Mitophagy är en process av selektiv borttagning av skadad eller onödiga mitokondrier med autofagi maskiner. Nära förbindelser har hittats mellan defekta mitophagy och olika sjukdomar, inklusive cancer, neurodegenerativa sjukdomar och metabola sjukdomar. Nya studier har dessutom visat att mitophagy är inblandad i normala cellulära processer, såsom differentiering och utveckling. De exakta roll och molekylära mekanismer bakom mitophagy kräver dock ytterligare studier. Därför är det viktigt att utveckla en robust och bekväm metod för att mäta förändringar i mitophagy verksamhet. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att kvantitativt bedöma mitophagy aktivitet genom flödescytometri använder mitokondrierna-riktade fluorescerande proteinet Keima (mt-Keima). Detta flöde flödescytometri assay kan analysera mitophagy aktivitet snabbare och känsligt än konventionella mikroskopi – eller immunoblotting-baserade metoder. Detta protokoll kan användas för att analysera mitophagy aktivitet i olika celltyper.
Introduction
Mitokondrierna är organeller som är nödvändiga för cellproliferation och fysiologi. Mitokondrierna är ansvarig för att generera mer än 80% av ATP leverans via oxidativ fosforylering, och de ger också olika metaboliska intermediärer för biosyntes och metabolism1,2. Förutom sina roller i energiförsörjningen och metabolism spelar mitokondrierna centrala roller i många andra viktiga processer, inklusive reaktivt syre arter (ROS) generation, regleringen av celldöd och intracellulära Ca2 + dynamics3 . Förändringar i mitokondriefunktion har förknippats med mänskliga sjukdomar, inklusive cancer, diabetes mellitus och olika neurodegenerativa sjukdomar4,5. Ökad mitokondriell dysfunktion och mitokondrie DNA-mutationer är också tänkt att bidra till normalt åldrande processer6,7,8. Kvalitetskontroll är därför en avgörande fråga i mitokondrierna. Mitokondrierna är högdynamiska organeller som kontinuerligt kan ändra sin form mellan långsträckt nätverk och kort, fragmenterade form. Mitokondrier dynamics spelar en viktig roll i att upprätthålla funktionen av mitokondrier samt deras nedbrytning genom mitophagy9.
Mitophagy är en mekanism som innebär selektiv nedbrytning av hela mitokondrier med autofagi maskiner. Mitophagy är principen mekanism underliggande mitokondriell omsättningen och avlägsnande av skadad eller dysfunktionella mitokondrier. I denna process är mitokondrierna först omgivna av ett membran, vilket resulterar i bildandet av autophagosomes, som sedan säkring med lysosomer för Hydrolytisk nedbrytning9. Tidigare genetiska studier i Drosophila har föreslagit att två Parkinsons sjukdom-relaterade gener, PTEN-inducerad förmodad kinase 1 (PINK1) (PARK6) och Parkin (PARK2), funktion i samma väg10,11. Kompletteringssystem studier har visat att PINK1-Parkin smittvägen är ansvarig för att eliminera skadade mitokondrier och defekter i detta utbildningsavsnitt resultat i dysfunktionella mitophagy och kan bidra till mänskliga sjukdomar12,13. Defekter i mitophagy processer har nyligen hittats i olika mänskliga sjukdomar, inklusive cancer, hjärtsjukdomar, leversjukdomar och neurodegenerativa sjukdomen 14. Dessutom har senaste studier också visat att mitophagy är avgörande för många fysiologiska processer, såsom differentiering, utveckling och immunsvar15,16,17,18 ,19, vilket tyder på att mitophagy kan spela en mer aktiv roll i att kontrollera cellfunktioner.
Trots senaste bekräftelse på att mitophagy spelar en viktig roll i både kvalitetskontroll i mitokondrier och mänskliga sjukdomar, de molekylära mekanismerna bakom mitophagy förblir dåligt förstått. Även om mitophagy-relaterade mekanismer har studerats systematiskt i jäst, har studier som syftar till att utforska mitophagy-relaterade mekanismer i däggdjursceller främst fokuserat på PINK1-Parkin vägen. Tidigare studier har fastställt att PINK1-Parkin smittvägen är primärt ansvarig för selektiv avlägsnande av skadade mitokondrier via mitophagy12,20,21. Senare studier har dock rapporterat att mitophagy i vissa modeller kan aktiveras även i avsaknad av den funktionella PINK122,23,24. Dessa resultat tyder på att förutom PINK1-Parkin vägen, där en ytterligare oidentifierade väg kan aktivera mitophagy.
Avsaknaden av en bekväm metod för att bedöma mitophagy verksamhet är ett stort hinder för att utforska de vägar som reglerar mitophagy och dess roll i patofysiologiska händelser. Elektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg att direkt visualisera autophagosome-uppslukade mitokondrier. Elektronmikroskopi har dock limitationsin kvantifiera mitophagy aktivitet. Även om strategier som använder mikrotubulära-associerade protein-1 ljus kedja 3 (LC3)-konjugerade fluorescerande sonder, såsom GFP-LC3, är för närvarande den mest använda metoder25, LC3-baserade signalen övergående karaktär och dess höga andelen falskt positiva signaler begränsa dess känslighet för att upptäcka mitophagy i celler26. En kombination av western blotting för att mäta mitokondriell proteinnivå, kvantifiering av mitokondrie-DNA och fluorescence mikroskopi analys colocalize mitokondrier med antingen autophagosomes eller lysosomer skulle vara en bra metod för att bedöma mitophagy. Emellertid, kvantifiering begränsningar och brist på bekvämligheten av befintliga metoder kräver nya strategier. Införandet av ett nytt pH-beroende fluorescerande protein, mitokondriell målet Keima (mt-Keima), förbättrad kraftigt förmåga att upptäcka mitophagy27. Genom att smälta mitokondrie-targeting sekvensen av cytokrom c oxidas subenhet VIII (COX VIII) in Keima, är mt-Keima riktad till mitokondriell matrisen. Den excitation peak av Keima stora förskjutningen från 440 nm till 586 nm (motsvarande pH 7 pH 4, respektive) kan användas för att bedöma mitophagy med bra känsligt i både in vitro- och in-vivo experiment28,29 . Viktigare, orsakar motståndet av mt-Keima till lysosomal nedbrytning integration av mt-Keima signalen i lysosomer, vilket möjliggör enkel kvantitativa mätningen av mitophagy aktivitet. Fluorescens förändring som sker i mt-Keima kan analyseras med hjälp antingen konfokalmikroskopi eller flow flödescytometri28,29. Ett flöde flödescytometri-baserad metod för att mäta mitophagy aktivitet med mt-Keima har dock inte lämnats i detalj hittills.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för ett flöde flödescytometri-baserad teknik för att mäta mitophagy aktivitet i celler med mt-Keima. Även om vi har här visat att flödescytometri Flödesanalys framgångsrikt upptäckt CCCP-inducerad mitophagy i HeLa celler uttrycker Parkin, kan denna teknik tillämpas på en mängd olika celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi en snabb och känslig metod för att mäta cellulär mitophagy aktivitet i celler som uttrycker mt-Keima med flödescytometri. Celler som genomgår en hög nivå av mitophagy uppvisar en ökad förhållandet mellan PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitation. Således kan mitophagy aktivitet uttryckas som andelen celler uppvisar en hög baserat på 561/405. Vi beräknas andelen celler i regionen ”hög” gate på en dot tomt på PE-CF594 (561 nm) kontra BV605 (405 nm), och resultaten visade att be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett stipendium från National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (till J. U.), och av National Research foundation av Korea (NRF) bidrag finansieras av den Korea government(MSIT) (nr 2016R1A2B2008887, nr 2016R1A5A2007009) (till J.Y .)
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
