الإنزيم لوسيفراس الفائق لتقييم بروتيوليسيس PCSK9 حوزتي واحدة--دوران
Summary
ويقدم هذا البروتوكول وسيلة لتقييم نشاط proteolytic حوزتي دوران جوهريا منخفضة النشاط، وواحدة في سياق خلوية. على وجه التحديد، يتم تطبيق هذا الأسلوب لتقييم نشاط بروتيوليتيك PCSK9، محرك رئيسي استقلاب الدهن نشاطها proteolytic مطلوب لوظيفتها هايبرتشوليستيروليميك في نهاية المطاف.
Abstract
كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/كيكسن نوع 9 (PCSK9) هو حوزتي واحدة–دوران الذي ينظم مستويات المصل low-density lipoprotein (LDL)، ومن ثم أمراض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من أن بروتيوليسيس PCSK9 مطلوب لأثره الكامل hypercholesterolemic، تقييم وظيفتها proteolytic التحدي: PCSK9 المعروف فقط تهزم نفسها، ويخضع لدوران واحد فقط، وبعد بروتيوليسيس، يحتفظ به الركيزة في موقعها النشط كسيارات-المانع. تصف الأساليب المعروضة هنا تحليل الذي يتغلب على هذه التحديات. التحليل يركز على proteolysis الجزيئات في إطار يستند إلى الخلية والانقسام الروابط الناجحة للنشاط يفرز لوسيفراس، والتي يمكن قراءتها بسهولة على المديين المتوسط ومكيفة. عبر خطوات متسلسلة من الطفرات وتعداء عابرة، وقراءات لوسيفراس، يمكن التحقيق المقايسة بروتيوليسيس PCSK9 تحت ظروف من اضطراب أو الوراثية الجزيئية في طريقة الفائق. هذا النظام أيضا مناسبة لكل تقييم البيوكيميائية مغلطه سريرياً اكتشفت واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة (بطانات)، كذلك فيما يتعلق بفحص مثبطات جزيء صغير من بروتيوليسيس PCSK9.
Introduction
PCSK9 يستهدف مستقبلات LDL (LDL-R) لتدهور، ورفع مستوى الكولسترول الضار (LDL-C) والقيادة أمراض القلب تصلب الشرايين1،2. قوة PCSK9 علاجية تستهدف خفض LDL-C وتحسين نتائج القلب والأوعية الدموية للمرضى، حتى عند إضافة علاج خفض الدهن عدوانية مع statins3،4. بيد أن العلاجات المعتمدة حاليا تقتصر على النهج القائم على الأجسام المضادة، وتعاني من نقص في الفعالية من حيث التكلفة5،6. لحل هذه المشكلة، هناك حاجة إلى بدائل علاجية أقل تكلفة، ووسيلة لتحديد المرضى الذين يحتمل أن الحصول على قدر أكبر من الفوائد، أو كليهما،.
النهج جزيء صغير يمكن أن تستهدف PCSK9 داخل الخلايا وتقدم عن طريق تحسين الإدارة وتخفيض التكاليف، وجعلها “الكأس المقدسة” في هذا المجال7. ومع ذلك، أثبت PCSK9 صعبة للمخدرات بالجزيئات الصغيرة. كما حوزتي، استهداف الدالة بروتيوليتيك PCSK9 لاستراتيجية جذابة، كما proteolysis المتمتعة بالحكم الذاتي هي الخطوة الحد من معدل نضج PCSK98 ومطلوب لأثره القصوى على LDL-ص9. حتى الآن، إلا أن هذه الاستراتيجية لم تكن ناجحة، يرجح أن سبب الكيمياء الحيوية الفريدة في PCSK9: PCSK9 كليفس سوى نفسه10، القيام بفعل واحد–دوران، وبعد المتمتعة بالحكم الذاتي-الانقسام، PCSK9 برودومين تظل ملزمة في الموقع النشط مثبط للسيارات11، منع قراءات من أي نشاط آخر في حوزتي.
تقدم هذه المقالة طريقة لتقييم دالة PCSK9 proteolytic في أزياء الفائق8. من خلال موقع الموجه الطفرات، يمكن استخدام المحققين هذا الفحص للتحقيق في آثار الترميز بطانات وجدت في العيادة تقييم هذه الآثار في بروتيوليسيس، هذه الخطوة الحد من معدل نضج PCSK9. بالإضافة إلى ذلك، سوف تكون هذه الطريقة مفيدة في تصميم شاشات الفائق لتحديد المغيرون بروتيوليسيس PCSK9، التي يتوقع أن في نهاية المطاف تعطيل عرض PCSK9 إلى LDL-R (وتعدل تأثير hypercholesterolemic PCSK9 ‘s) . وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن تكييفه البروتياز الأخرى مع جوهرها قلة النشاط، شريطة أن ط) زوج حوزتي الركازة محددة ويمكن الاطلاع على، والثاني) رابط داخل الخلايا مناسبة يمكن أن تنشأ للركيزة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراءات التجريبية المذكورة أعلاه يقدم طريقة للتغلب على نشاط متدنية ارتباطاً وثيقا حوزتي واحدة–دوران PCSK9 وتقييم وظيفتها بروتيوليتيك بطريقة قوية. والمفهوم الرئيسي للمقايسة يعتمد على تحويل حدث واحد–دوران قراءات تضخيم انزيماتيكالي. وتشمل مواطن القوة المقايسة زمني قصير نسبيا وسهولة الاس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون دعم التمويل السخي من نهلبي/المعاهد الوطنية للصحة (K08 HL124068 و LRP HMOT1243)، والمعاهد الوطنية للصحة/نكاتس عن طريق UCSF السريرية ومتعدية معهد محفز برنامج العلوم (UL1 TR000004)، UCSF الأكاديمي، مؤسسة هيلمان، جائزة الباحث بحوث العلوم جلعاد وجائزة فايزر اسباير القلب والأوعية الدموية (كل إلى جون س. كوربا) ومعهد هاوارد هيوز الطبي (لادري م. غالبان وكيفان م. شوكت).
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 – A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
