Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9
Summary
Este protocolo presenta un método para evaluar la actividad proteolítica de una proteasa de rotación intrínseca baja actividad, solo en un contexto celular. Específicamente, este método se aplica para evaluar la actividad proteolítica de PCSK9, un factor clave del metabolismo de los lípidos cuya actividad proteolítica se requiere para su última función hipercolesterolémicos.
Abstract
Cualquiera convertasa subtilisin/kexin tipo 9 (PCSK9) es una proteasa de facturación solo que regula los niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) y, en consecuencia, las enfermedades cardiovasculares. Aunque PCSK9 proteólisis se requiere para su efecto completo hipercolesterolémicos, la evaluación de su función proteolítica es un reto: PCSK9 sólo es conocido por sí mismo allegarse se somete sólo un volumen único y después de la proteólisis, conserva su sustrato en su sitio activo como inhibidor de auto. Los métodos presentados aquí describen un ensayo que supera estos desafíos. El análisis se centra en la proteólisis intermolecular en un contexto basado en la célula y escote acertado enlaces a la actividad de luciferasa secretada, que puede ser fácilmente leída hacia fuera en el medio condicionado. Mediante pasos secuenciales de mutagénesis, transitorios de la transfección y una lectura de luciferasa, el ensayo puede probar PCSK9 proteólisis en condiciones de perturbación ya sea genética o molecular de un modo de alto rendimiento. Este sistema es idóneo para ambos la evaluación bioquímica de clínicamente descubierto sin sentido solo polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), así en cuanto a la proyección de los inhibidores de molécula pequeña de proteólisis PCSK9.
Introduction
PCSK9 apunta el receptor de LDL (LDL-R) para la degradación, elevar el colesterol LDL (LDL-C) y conducir a enfermedad aterosclerótica del corazón1,2. Terapéutica dirigida a PCSK9 robusta reducir C-LDL y mejorar los resultados cardiovasculares de los pacientes, incluso cuando se añade a una agresiva terapia hipolipemiante con estatinas3,4. Sin embargo, las terapias actualmente aprobadas se limitan a enfoques basados en anticuerpos y sufren de falta de rentabilidad de5,6. Para resolver este problema, se necesitan alternativas terapéuticas menos costosos, a fin de identificar a los pacientes capaces de obtener mayores beneficios, o ambos.
Enfoques de molécula pequeña podrían objetivo intracelular PCSK9, proporcionan una mejor vía de administración y reducir los costos, haciendo que el “Santo Grial” en esta zona7. Sin embargo, PCSK9 ha probado difícil de droga por pequeñas moléculas. Como una proteasa, dirigida a la función proteolítica de PCSK9 es una estrategia atractiva, como uno mismo-proteólisis es el paso tarifa-limitador de PCSK9 maduración8 y se requiere para su máximo efecto sobre el LDL-R9. Hasta la fecha, sin embargo, esta estrategia no ha tenido éxito, probablemente debido a la bioquímica única de PCSK9: PCSK9 solamente sí mismo segmenta10, realizando una reacción single-facturación y después uno mismo-escote, la PCSK9 prodomain sigue siendo límite en el sitio activo como una auto-inhibidor11, impidiendo la lectura de cualquier otra actividad de proteasa.
Este artículo presenta un método para evaluar la función proteolítica PCSK9 en moda alto rendimiento8. Mediante mutagénesis sitio-dirigida, los investigadores pueden utilizar este análisis para los efectos de la codificación de SNPs encontradas la clínica para evaluar efectos sobre la proteólisis, el paso de limitación de velocidad de maduración PCSK9. Además, este método será útil en el diseño de pantallas de alto rendimiento para identificar moduladores de proteólisis PCSK9, que se prevén que, en definitiva, alterar la presentación de PCSK9 en el LDL-R (y modulan efectos hipercolesterolémicos de PCSK9) . Por último, este protocolo puede ser adaptado a otras proteasas con actividad intrínsecamente baja, siempre que i) un par de sustrato-proteasa específica puede encontrarse, y ii) un anclaje intracelular adecuado puede establecerse para el substrato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los procedimientos experimentales descritos presentan un método para superar la actividad intrínsecamente baja de la facturación única proteasa PCSK9 y evaluar su función proteolítica de forma robusta. El concepto clave del análisis se basa en convertir un evento de facturación solo en una lectura enzimático amplificado. Las fortalezas del análisis incluyen el relativamente poco tiempo y facilidad de uso del reportero de luciferasa, así como su escalabilidad a los enfoques de alto rendimiento. Además, el ensa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero generoso del NHLBI/NIH (HL124068 K08 y LRP HMOT1243), NCATS/NIH a través de la UCSF clínica y traslacional Instituto catalizador programa de ciencia (UL1 TR000004), el Senado académico de la UCSF, la Fundación Hellman, un Gilead Sciences Research Scholar Award, un premio Cardiovascular Pfizer ASPIRE (todos John S. Chorba) y el Howard Hughes Medical Institute (a Adri M. Galván y Kevan M. Shokat).
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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