Высок объём Люцифераза Assay для оценки протеолиза PCSK9 сингл оборот протеазы
Summary
Этот протокол предоставляет метод для оценки протеолитической активности протеаз неразрывно низкой активности, один оборот в сотовой связи. В частности этот метод применяется для оценки протеолитической активности PCSK9, ключевым фактором липидного обмена, чьи протеолитической активности требуется для его конечной употреблением функции.
Abstract
Proprotein конвертазы Субтилизин/kexin тип 9 (PCSK9) — сингл оборот протеазы, который регулирует сыворотке крови липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и, следовательно, сердечно-сосудистых заболеваний. Хотя PCSK9 Протеолиз требуется для его полной повышенным эффектом, оценки его протеолитического функции сложной: PCSK9 известна только само прилепится, проходит только один оборот и после протеолиза, сохраняет ее субстрат в ее активные сайт как auto ингибитора. Представленные здесь методы описывают assay который преодолевает эти проблемы. Assay фокусируется на межмолекулярных протеолиза в ячейки на основе контекста и успешных расщепления ссылки секретируемые Люцифераза деятельности, которые могут быть легко прочитаны в среде с кондиционерами. Через последовательные шаги мутагенеза, переходных transfection и индикация Люцифераза, assay может зонд PCSK9 Протеолиз в условиях либо генетических и молекулярных возмущений в духе высокой пропускной способности. Эта система хорошо подходит для обоих биохимической оценки клинически выявленных Миссенс сингл-полиморфизмы нуклеотидов (ОНП), а также что касается скрининга мелкомолекулярных ингибиторы протеолиза PCSK9.
Introduction
PCSK9 цели рецепторов ЛПНП (ЛПНП-R) для деградации, поднимая LDL холестерина (LDL-C) и вождения атеросклеротического заболевания сердца1,2. Терапии таргетинга PCSK9 решительно снизить LDL-C и улучшить сердечно-сосудистые исходы для пациентов, даже при добавлении агрессивный липидов понижая терапии статинами3,4. Однако, в настоящее время утвержденных терапии ограничены подходы на основе антител и страдают от отсутствия экономичности5,6. Чтобы решить эту проблему, необходимы менее дорогостоящим терапевтической альтернативы, средства для выявления больных, скорее всего получить более значительные выгоды, или оба.
Мелкомолекулярных подходы могут целевых внутриклеточных PCSK9, обеспечивают улучшение маршрут администрации и сокращения расходов, что делает их «Святой Грааль» в этой области7. Однако PCSK9 оказалось трудно наркотиков в малых молекул. Как протеазы ориентация протеолитических функция PCSK9 является привлекательной стратегией, как self протеолиза тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания8 и является обязательным для максимального эффекта на ЛПНП-R9. На сегодняшний день, однако, эта стратегия не удалось, вероятно из-за PCSK9 в уникальный биохимии: PCSK9 расщепляет только сам10, выполняя один оборот реакции, и после self расщепление, остается связанным на активном узле как PCSK9 prodomain Авто ингибитор11, предотвращая индикация любой дальнейшей активности протеаз.
Эта статья представляет метод для оценки PCSK9 протеолитической функция в высок объём моды8. Через сайт направленного мутагенеза следователи можно использовать этот assay зонда эффекты кодирования ОНП в клинике для оценки их воздействия на протеолиза, тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания. Кроме того этот метод будет полезна в разработке экранов высокой пропускной способностью для выявления модуляторы протеолиза PCSK9, которые, как ожидается, в конечном итоге сорвать презентация PCSK9 ЛПНП-r (и модулировать PCSK9 повышенным эффектом) . Наконец этот протокол может быть адаптирована к другим протеаз с неразрывно низкая активность, условии, что i) конкретного субстрата протеазы пара можно найти, и ii) привязку подходящего внутриклеточных могут быть установлены для субстрата.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные выше экспериментальной процедуры представляют способ преодолеть неразрывно низкой активности протеаз сингл оборот PCSK9 и оценить его протеолитического функция на надежной основе. Ключевая концепция assay полагается на преобразования одного оборота событий в ферментационно и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят щедрой финансовой поддержке NHLBI/низ (K08 HL124068 и LRP HMOT1243), NCATS/низ через UCSF клинических и поступательного науки Института катализатор программы (УЛ1 TR000004), UCSF академического Сената, Хеллман фонд, Галааде наук исследования ученый премии, Pfizer ASPIRE сердечно-премии, (все для Джон S. чорба) и Говард Хьюз медицинский институт (до Galvan Adri м. и. м. Шокат Кеван).
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 – A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
