シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 のタンパク質分解を評価する高スループット ルシフェラーゼ アッセイ
Summary
このプロトコルは、携帯電話のコンテキストで本質的に低活動、シングル売り上げ高プロテアーゼの活性を評価する方法を示します。具体的には、このメソッドは、PCSK9 のプロテアーゼ活性はその究極の高コレステロール血症の機能に必要な脂質代謝の主要ドライバーのプロテアーゼ活性の評価に適用されます。
Abstract
プロタンパク質転換酵素サチライシン/kexin タイプ 9 (PCSK9) は血清低密度リポタンパク質 (LDL) を調節するシングル売り上げ高プロテアーゼとその結果、心血管疾患。PCSK9 分解は完全高コレステロール血症効果に必須ですが、蛋白機能の評価は挑戦: PCSK9 自体を切断にのみ知られている、単一回転率だけを受けるし、タンパク質分解の後で、基板を保持自動-阻害剤として活性部位。ここで紹介する方法は、これらの課題を克服するアッセイをについて説明します。試金はセル ベースのコンテキストとリンク馴化培地で簡単に読み取ることができます分泌ルシフェラーゼの活動に成功した胸の谷間に分子分解について説明します。経由で突然変異誘発、トランスフェクション、ルシフェラーゼの読み出しのシーケンシャル手順アッセイは、高スループット方法で PCSK9 蛋白酵素の遺伝学的または分子の摂動の条件を調べることができます。このシステムは、臨床的に検出されたミスセンス単一ヌクレオチドの多形 (SNPs) 同様 PCSK9 タンパク質分解の小分子阻害剤のスクリーニングの両方生化学的評価に適しています。
Introduction
LDL コレステロール (LDL-C) を上げると動脈硬化性心臓病1,2を運転、PCSK9 は劣化の LDL 受容体 (LDL-R) を対象します。治療ターゲット PCSK9 はしっかり LDL-C を下げるし、スタチン3,4積極的脂質低下療法に追加される場合でも患者は、心血管アウトカムを改善します。ただし、現在承認された治療法抗体ベースのアプローチに限定され、費用対効果5,6の不足に苦しみます。この問題を解決するためにより少なく高価な治療選択肢、大きなメリットを得るために可能性が高い患者を識別する手段またはその両方が必要です。
小分子アプローチが細胞内 PCSK9 をターゲットの管理、改善されたルートを提供し、このエリア7で、「聖杯」を作るコストを削減します。ただし、PCSK9 は小分子による薬物に困難証明しています。、プロテアーゼとして PCSK9 の蛋白分解機能のターゲット、魅力的な戦略と自己タンパク質分解 PCSK9 成熟8の率制限ステップは、LDL R9その最大効果のため必要です。日には、ただし、この戦略は成功していない、PCSK9 のユニークな生化学による可能性が高い: PCSK9 裂くだけ10、シングル売り上げ高反応を実行する、自己-胸の谷間後、PCSK9 prodomain ままとしてアクティブ サイトでバインドされている、自動阻害剤11、任意のさらなるプロテアーゼ活性の読み出しを防止します。
高スループット方法8PCSK9 蛋白分解機能を評価する手法を提案します。サイト指示された突然変異誘発、を通じて捜査官は、PCSK9 成熟の率制限ステップ、タンパク質分解に及ぼす影響を評価するのに診療所は、SNPs を符号化の効果を調査するのにこのアッセイを使用できます。さらに、このメソッドは、LDL r PCSK9 のプレゼンテーションを妨害 (、PCSK9 の高コレステロール血症効果を調節する) 最終的に期待されている、PCSK9 のタンパク質分解の変調器を識別するために高速画面の設計に役に立つでしょう.最後に、このプロトコルは i) 特定の基板プロテアーゼのペアを見つけることができます、ため基板 ii) 適切な細胞内アンカーを確立する、本質的に低活動で、他のプロテアーゼに適応することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記実験の手順は、シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 の本質的に低活動を克服し、堅牢な方法でそのタンパク質の機能を評価する方法を提示します。アッセイの重要な概念は、酵素によって増幅された読み出しにシングル売り上げ高イベントを変換するのに依存します。アッセイの強みには、比較的短い時間枠と高スループット方法にそのスケーラビリティと同様、ルシフェラーゼ レ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者に感謝 NHLBI/NIH (K08 HL124068 と LRP HMOT1243)、UCSF 臨床と医療科学研究所触媒プログラム (UL1 TR000004)、UCSF 学術上院ヘルマン財団を通じて NCATS/NIH から寛大な資金調達支援、ギリアド サイエンス研究学者賞、(すべてジョン s. Chorba) ファイザーが熱望する心血管賞、ハワード ヒューズ医学研究所 (に Adri 雅・ ガルバン、ケバン M. Shokat)。
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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