Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

Summary

Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.

Abstract

Proprotein convertase subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) é uma protease de single-volume de negócios que regula os níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) de soro e, consequentemente, as doenças cardiovasculares. Embora PCSK9 proteólise é necessária para seu efeito completo hipercolesterolêmicos, a avaliação da sua função proteolítica é desafiador: PCSK9 só é conhecido para decompor-se, submete-se apenas um único volume de negócios e após proteólise, retém seu substrato em seu sítio ativo como um inibidor de auto. Os métodos apresentados aqui descrevem um ensaio que supera esses desafios. O ensaio centra-se na proteólise intermolecular em um contexto de baseada em célula e decote bem sucedida de ligações para a atividade de luciferase secretada, que pode ser facilmente lido para fora no meio de condicionado. Através de etapas sequenciais de mutagénese, transfecção transiente e uma leitura de luciferase, o ensaio pode sonda PCSK9 proteólise em condições de perturbação genética ou molecular de forma de alta produtividade. Este sistema é adequado para ambos avaliação bioquímica de missense clinicamente descobertos single-nucleotide polimorfismos (SNPs), bem como quanto a triagem de inibidores da pequeno-molécula de proteólise PCSK9.

Introduction

PCSK9 metas o receptor de LDL (LDL-R) para degradação, aumentando o LDL colesterol (LDL-C) e conduzir a doença aterosclerótica do coração^1,2. Terapêutica alvo PCSK9 robustamente abaixar o LDL-C e melhorar resultados cardiovasculares para pacientes, mesmo quando adicionado a uma terapia agressiva hipolipemiantes com estatinas^3,4. Terapias actualmente aprovadas limitam-se a abordagens baseadas em anticorpos, no entanto e sofrem com a falta de rentabilidade^5,6. Para resolver este problema, alterna....

Protocol

1. local-dirigido Mutagenesis de Protease Vector

1. Design e ordem personalizada-sintetizados oligonucleotides instalar uma mutação de interesse usando uma modificação do padrão mutagenesis local-dirigido protocolos¹². Norma primeiras demão demolhadas (sem purificação adicional) são perfeitamente aceitáveis.
   Nota: Uma abordagem geral para projetos cartilha envolve a criação de cartilhas parcialmente sobrepostas conforme indicado na tabela 1, usando uma calculadora de temperatura (T_m) derretimento específica para o polymerase de interesse.
2. Criar reacções em cadeia do polymerase (PCR) para o mutagen....

Results

O ensaio de proteólise de alto rendimento depende de superar três grandes desafios. Primeiro, para superar a saída intrinsecamente baixa de uma protease de PCSK9 single-volume de negócios, uma protease PCSK9 falta o inibitório prodomínio é usado, com a sequência de clivagem na cauda do prodomínio ligada a um luciferase que pode ser secretada¹⁴. Em segundo lugar, para satisfazer a necessidade da protease de dobrar em complexo com sua inibitório prodomínio, que os do.......

Discussion

Os procedimentos experimentais descritos acima apresentam um método para superar a intrinsecamente baixa atividade de protease a single-volume de negócios PCSK9 e avaliar sua função proteolítica de forma robusta. O conceito-chave do ensaio depende de conversão de um evento único-volume de negócios em uma leitura enzimaticamente amplificada. Os pontos fortes do ensaio incluem o prazo relativamente curto e facilidade de uso do repórter do luciferase, bem como sua capacidade de expansão para abordagens de alto rendimento. A.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de PCR	EUA Scientific	1402-2900	para PCR
Q5 Hot Start	New England Biolabs	M0493L	de DNA polimerase de alta fidelidade
	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (para PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Autores	n / a	Disponível dos autores
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A	Autores	n/a	Disponível dos autores
Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	Para géis de DNA
E-Gel Imager System com Base de Luz Azul	ThermoFisher Scientific	4466612	Para geração de imagens de géis de DNA
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	Para géis de DNA
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	Para tampão de gel de DNA
Ácido acético glacial	ThermoFisher Scientific	A38-500	Para tampão de gel de DNA
Solução de ácido etilenodiaminotetracético	Millipore Sigma	3690	EDTA, para buffer de gel de DNA
1 kb Escada de DNA	Gold Biotechnology	D010	Escada de DNA
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Enzima de restrição
Placas de ágar LB com 100 µ g / mL de carbenicilina	Teknova	L1010	LB-Carb placas
One Shot Mach1 T Resistente a fagos quimicamente competentes E. coli< / em>	ThermoFisher Scientific	C862003	Células quimicamente competentes
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
Carbenicillin	Gold Biotechnology	C-103-5	Antibiótico seletivo
E.Z.N.A. Plasmídeo Mini Kit I	Omega BioTek	D6942-02	Kit Miniprep de Purificação de DNA
NanoDrop 2000 Espectrofotômetro	ThermoFisher Scientific	ND-2000C
Células 293T Coleção	Americana de Cultura de Tecidos (ATCC)	CRL-3216	Células HEK 293T
DMEM, glicose alta, piruvato	ThermoFisher Scientific	11995065	DMEM, célula de mamífero mídia
Fetal Bovino Sera	Axenia Biologix	F001	FBS
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	ThermoFisher Scientific	25300062	Tripsina, para dissociação celular
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Countess contador de células automatizado	ThermoFisher Scientific	C10227	Contagem automatizada de células
Lâminas para câmara de contagem de células	Countess ThermoFisher Scientific	C10228	Lâminas para contagem de células
Placas de Cultura de Tecidos CELLSTAR, Brancas, Brancas, com Tampa	Grenier Bio-One	655083	Placa de 96 poços branca, fundo branco
Placa PCR de 96 poços TempPlate não contornada Placa PCR de 96 poços, natural	USA Scientific	1402-9596	Placa de 96 poços para placa de plasmídeo mestre
Nunc 2.0mL DeepWell Placas	ThermoFisher Scientific	278743	placa de 96 poços profundos
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	Reagente de transfecção de lipídios, Reagente Lf3K
P3000 Reagente	de pré-complexação de DNA	L3000008	ThermoFisher Scientific
meio de soro reduzido Lf3K OptiMEM I	ThermoFisher Scientific	31985062	Meio de soro reduzido para transfecção
(+)-L-ascorbato de sódio	Millipore	Sigma A4034	Ascorbato de sódio
Cloreto de sódio	Millipore Sigma	S9888	NaCl
Albumina, soro bovino, fração V, baixo teor de metais pesados	Millipore Sigma	12659	BSA
Metanol (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
Ácido clorídrico	VWR	JT9535-2	Concentrado HCl
Coelenterazina	Gold Biotechnology	CZ2.5	substrato de luciferase
, estéril	ThermoFisher Scientific	09-720-3	Filtro estéril, PVDF, 0,22 µ
Pipeta Multicanal Pipet-Lite L12-200XLS+	Pipeta	Multicanal 17013810	Pipeta Multicanal
Pipet-Lite L12-20XLS+	Pipeta	Multicanal 17013808
Pipeta Multicanal Pipet-Lite L12-10XLS+	Pipeta	Multicanal 17013807	Rainin Reservatório
reagentes	Corning	4870	Calha para reagentes
Tubos de centrífuga, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	Tubos de 15 mL
Tubos de centrífuga, 50 mL	Corning	430829	tubos de 50 mL
Leitor de microplacas Spark	Tecan	N/a	Leitor de placas
Excel	Microsoft	2016 para Mac	Software de planilha
Prism	GraphPad Software	v7	Software de análise de dados científicos