Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios
Summary
Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.
Abstract
Proprotein convertase subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) é uma protease de single-volume de negócios que regula os níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) de soro e, consequentemente, as doenças cardiovasculares. Embora PCSK9 proteólise é necessária para seu efeito completo hipercolesterolêmicos, a avaliação da sua função proteolítica é desafiador: PCSK9 só é conhecido para decompor-se, submete-se apenas um único volume de negócios e após proteólise, retém seu substrato em seu sítio ativo como um inibidor de auto. Os métodos apresentados aqui descrevem um ensaio que supera esses desafios. O ensaio centra-se na proteólise intermolecular em um contexto de baseada em célula e decote bem sucedida de ligações para a atividade de luciferase secretada, que pode ser facilmente lido para fora no meio de condicionado. Através de etapas sequenciais de mutagénese, transfecção transiente e uma leitura de luciferase, o ensaio pode sonda PCSK9 proteólise em condições de perturbação genética ou molecular de forma de alta produtividade. Este sistema é adequado para ambos avaliação bioquímica de missense clinicamente descobertos single-nucleotide polimorfismos (SNPs), bem como quanto a triagem de inibidores da pequeno-molécula de proteólise PCSK9.
Introduction
PCSK9 metas o receptor de LDL (LDL-R) para degradação, aumentando o LDL colesterol (LDL-C) e conduzir a doença aterosclerótica do coração1,2. Terapêutica alvo PCSK9 robustamente abaixar o LDL-C e melhorar resultados cardiovasculares para pacientes, mesmo quando adicionado a uma terapia agressiva hipolipemiantes com estatinas3,4. Terapias actualmente aprovadas limitam-se a abordagens baseadas em anticorpos, no entanto e sofrem com a falta de rentabilidade5,6. Para resolver este problema, alternativas terapêuticas menos onerosos, um meio para identificar pacientes propensos a obter maiores benefícios, ou ambos, são necessários.
Abordagens da pequeno-molécula poderiam alvo PCSK9 intracelular, fornecer uma melhor via de administração e reduzir custos, tornando-o “Santo Graal” nesta zona7. No entanto, PCSK9 provou difícil de drogas por pequenas moléculas. Como uma protease, direcionamento função proteolítica do PCSK9 é uma estratégia atraente, como autoproteólise é a etapa limitante de PCSK9 maturação8 e é necessário para o seu máximo efeito no LDL-R9. Até à data, no entanto, esta estratégia não teve êxito, provavelmente devido a bioquímica exclusiva do PCSK9: PCSK9 apenas se fende10, realizando uma reação de single-volume de negócios, e depois autoclivagem, o PCSK9 prodomínio permanece ligado no sítio activo como um autoinibidor11, impedindo a leitura de qualquer atividade de protease mais.
Este artigo apresenta um método para avaliar PCSK9 função proteolítica na moda do elevado-throughput8. Através do mutagenesis local-dirigido, investigadores podem usar este teste para investigar os efeitos da codificação SNPs encontrados na clínica para avaliar os efeitos na proteólise, a etapa limitante de maturação PCSK9. Além disso, este método será útil no design de telas de alta produtividade para identificar moduladores de PCSK9 proteólise, que são antecipadas para, finalmente, interromper a apresentação de PCSK9 ao LDL-r (e modulam hipercolesterolêmicos efeito do PCSK9) . Por último, este protocolo pode ser adaptado para outras proteases com intrinsecamente baixa atividade, desde que i) um par de substrato-protease específico pode ser encontrado, e ii) uma âncora intracelular adequada pode ser estabelecida para o substrato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os procedimentos experimentais descritos acima apresentam um método para superar a intrinsecamente baixa atividade de protease a single-volume de negócios PCSK9 e avaliar sua função proteolítica de forma robusta. O conceito-chave do ensaio depende de conversão de um evento único-volume de negócios em uma leitura enzimaticamente amplificada. Os pontos fortes do ensaio incluem o prazo relativamente curto e facilidade de uso do repórter do luciferase, bem como sua capacidade de expansão para abordagens de alto ren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças ao apoio generoso financiamento do NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH através da UCSF clínica e translacional ciência Instituto catalisador programa (UL1 TR000004), o Senado académico UCSF, a Fundação de Hellman, um Gilead Sciences Research Scholar Award, um prêmio Pfizer ASPIRE Cardiovascular (todos John S. Chorba) e do Howard Hughes Medical Institute (para Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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