단일-매출 Protease PCSK9의 베이스를 평가 하는 높은 처리량 Luciferase 분석 결과
Summary
이 프로토콜 셀룰러 맥락에서 본질적으로 낮은 활동, 단일 매출 효소의 분해 활동을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 특히,이 메서드는 PCSK9, 그 분해 활동은 그것의 궁극적인 노인 기능에 필요한 지질 대사의 핵심 드라이버의 분해 활동을 평가에 적용 됩니다.
Abstract
Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9) 형식이 단일 매출 protease 혈 청 저밀도 지 단백질 (LDL) 수치를 조절 하 고, 따라서, 심장 혈관 질병. PCSK9 베이스에 필요 하지만 전체 콜레스테롤 효과, 분해 기능 평가 도전 이다: PCSK9 자체 쪼개만 알려져, 겪 습만 단일 회전율, 및 베이스, 후에 그것의 기질을 유지 자동-억제제로 그것의 활성 사이트입니다. 여기에 제시 된 방법을 이러한 문제를 극복 하는 분석 결과 설명 합니다. 분석 결과 셀 컨텍스트 및 링크 쉽게 읽을 수 있습니다 밖으로 바른된 매체에 은닉 luciferase 활동에 성공적인 분열 intermolecular 베이스에 집중 한다. 통해 순차적 단계 mutagenesis, 과도 transfection 그리고 luciferase 판독, 분석 결과 높은 처리량 방법에서 유전적 또는 분자 섭 동의 조건 하에서 PCSK9 베이스를 프로브 수 있습니다. 이 시스템은 임상 발견된 missense 단일 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp), 또한 PCSK9 베이스의 작은 분자 억제제의 심사에 관해서는 모두 생 화 학적 평가 대 한 적합 합니다.
Introduction
LDL 콜레스테롤 (LDL-콜레스테롤)을 제기 하 고 동맥 경 화성 심장 질환1,2운전 PCSK9 성능 저하, LDL 수용 체 (LDL-R)를 대상. 치료 대상 PCSK9 튼튼하게 LDL-콜레스테롤을 낮출 하 고 적극적인 지질을 낮추는 치료 스타 틴3,4에 추가 하는 경우에 환자에 대 한 심장 혈관 결과 개선. 그러나 현재 승인 된 치료 항 체 기반 접근에 제한 된다, 그리고 비용 효율성5,6의 부족에서 고통. 이 문제를 해결 하려면 비용이 많이 드는 치료 대안, 환자 더 큰 혜택을 얻을 것을 식별 하는 수단 또는 둘 다 필요 합니다.
작은 분자 접근은 세포내 PCSK9 대상, 관리의 향상 된 경로 제공 고 비용, 그들에 게이 지역7에 있는 “성배”를 줄일 수 있습니다. 그러나, PCSK9 작은 분자 약물 어려운 입증 했다. 한 효소로 PCSK9의 분해 기능을 대상으로 자체 베이스 PCSK9 성숙8 의 속도 제한 단계가 고 LDL-R9에 그것의 최대 효과 위해 필요한 매력적인 전략 이다. 그러나 현재까지,,이 전략 하지 않은 성공 가능성이 PCSK9의 고유한 생화학 때문: PCSK9 앞만 자체10, 수행 하는 단일-매출 반응, 그리고 자기 분열 후 PCSK9 prodomain와 활성 사이트에 바인딩된는 자동-억제제11, 어떤 더 프로 테아 제 활동의 판독을 방지.
이 문서는 높은 처리량 패션8PCSK9 분해 기능을 평가 하는 메서드를 제공 합니다. 사이트 지시 된 mutagenesis, 통해 조사자는 베이스, PCSK9 성숙의 속도 제한 단계에 효과 대 한 그들을 평가 하기 위해 병원에서 발견 하는 Snp 코딩의 효과 조사 하이 분석 결과 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 궁극적으로 LDL-r PCSK9의 프레 젠 테이 션을 방해 (및 변조 PCSK9의 콜레스테롤 효과) 것으로 예상 되는 PCSK9 베이스의 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 스크린의 설계에 도움이 될 것입니다. . 마지막으로,이 프로토콜은 i) 특정 기질-효소 쌍을 찾을 수 있습니다, 고 기판에 대 한 ii)는 적당 한 세포내 앵커를 설정할 수 있습니다 본질적으로 낮은 활동, 다른 프로 테아 제를 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 실험 절차 단일 매출 protease PCSK9의 본질적으로 저조를 극복 하 고 강력한 방식으로 분해 기능을 평가 하는 방법을 제시. 분석 결과의 주요 개념 효소 증폭된 판독 단일 매출 이벤트 변환에 의존 합니다. 분석 결과의 강점 등는 상대적으로 짧은 시간 프레임 luciferase 기자는 확장성 높은 처리량 접근의 사용의 용이성. 또한, 분석 결과 네이티브, 셀룰러 맥락에서 베이스를 평가합니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 감사 NHLBI/NIH (K08 HL124068 및 LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF 임상 및 변환 과학 연구소 촉매 프로그램 (UL1 TR000004), UCSF 학술 상원 헬 맨 재단에서 관대 한 자금 지원을 한 길 르 앗 과학 연구 학술 상, (모두 존 S. Chorba) 화는 심장 혈관 상 고 (Adri M. Galvan Kevan M. Shokat)를 하 워드 휴즈 의학 연구소.
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
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