यह प्रोटोकॉल एक आंतरिक रूप से कम गतिविधि, एक सेलुलर संदर्भ में एक कारोबार को छेड़ने की proteolytic गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । विशेष रूप से, इस विधि PCSK9 की proteolytic गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जाता है, लिपिड चयापचय जिसका proteolytic गतिविधि अपने परम hypercholesterolemic समारोह के लिए आवश्यक है की एक प्रमुख ड्राइवर.
प्रोटीन convertase subtilisin/kexin प्रकार 9 (PCSK9) एक एकल कारोबार छेड़ने जो सीरम कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) के स्तर को नियंत्रित करता है और, फलस्वरूप, हृदय रोग है । हालांकि PCSK9 प्रोटियोलिसिस अपने पूर्ण hypercholesterolemic प्रभाव के लिए आवश्यक है, अपने proteolytic समारोह के मूल्यांकन को चुनौती दे रहा है: PCSK9 ही है, केवल एक ही कारोबार से गुजरना जाना जाता है, और प्रोटियोलिसिस के बाद, अपने सब्सट्रेट में बरकरार रखती है एक ऑटो अवरोधक के रूप में अपनी सक्रिय साइट । यहां प्रस्तुत तरीकों का वर्णन एक परख जो इन चुनौतियों पर काबू । परख एक सेल में आण्विक प्रोटियोलिसिस पर केंद्रित संदर्भ आधारित है और गुप्त luciferase गतिविधि है, जो आसानी से वातानुकूलित माध्यम में पढ़ा जा सकता है के लिए सफल दरार लिंक । mutagenesis, क्षणिक अभिकर्मक, और एक luciferase readout के अनुक्रमिक कदम के माध्यम से, परख या तो आनुवंशिक या आणविक PCSK9 की शर्तों के तहत एक उच्च प्रवाह तरीके से प्रोटियोलिसिस गड़बड़ी जांच कर सकते हैं । इस प्रणाली को अच्छी तरह से दोनों के लिए अनुकूल है जैव रासायनिक मूल्यांकन की खोज की नैदानिक पता चला भावना एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs), साथ ही के लिए छोटे PCSK9 प्रोटियोलिसिस के अणु अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए ।
PCSK9 एलडीएल रिसेप्टर (एलडीएल-आर) क्षरण के लिए लक्ष्य, एलडीएल कोलेस्ट्रॉल की स्थापना (एलडीएल-सी) और ड्राइविंग atherosclerotic हृदय रोग1,2। चिकित्सकीय लक्ष्यीकरण PCSK9 मजबूती से कम एलडीएल-सी और रोगियों के लिए हृदय परिणामों में सुधार, यहां तक कि जब एक आक्रामक लिपिड में जोड़ा-statins3,4के साथ चिकित्सा कम । वर्तमान में अनुमोदित चिकित्सा एंटीबॉडी-आधारित दृष्टिकोण तक सीमित हैं, तथापि, और लागत की कमी से पीड़ित-प्रभावशीलता5,6. इस समस्या को हल करने के लिए, कम महंगा चिकित्सकीय विकल्प, एक के लिए अधिक से अधिक लाभ, या दोनों, लाभ की संभावना रोगियों की पहचान का मतलब है, की जरूरत है ।
छोटे अणु दृष्टिकोण intracellular PCSK9 लक्ष्य सकता है, प्रशासन के एक बेहतर मार्ग उपलब्ध कराने, और लागत को कम करने, उंहें “पवित्र कंघी बनानेवाले की रेती” इस क्षेत्र में7। हालांकि, PCSK9 छोटे अणुओं द्वारा दवा के लिए मुश्किल साबित कर दिया है । एक को छेड़ने के रूप में, लक्ष्यीकरण PCSK9’s proteolytic समारोह एक आकर्षक रणनीति है, के रूप में स्वयं प्रोटियोलिसिस PCSK9 परिपक्वता8 के दर को सीमित कदम है और एलडीएल-आर9पर अपनी अधिक से अधिक प्रभाव के लिए आवश्यक है । तारीख करने के लिए, तथापि, इस रणनीति सफल नहीं किया गया है, PCSK9’s अद्वितीय जैव रसायन के कारण होने की संभावना: PCSK9 ही10सट, एक एकल कारोबार प्रतिक्रिया प्रदर्शन, और आत्म दरार के बाद, PCSK9 डोमेन सक्रिय साइट में एक के रूप में बंधे रहता है ऑटो-अवरोधक11, किसी भी आगे की readout गतिविधि को रोकने के ।
यह लेख उच्च प्रवाह फैशन8में PCSK9 proteolytic समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । साइट के माध्यम से निर्देशित mutagenesis, जांचकर्ताओं इस परख का उपयोग करने के लिए क्लिनिक में पाया SNPs कोडिंग के प्रभाव जांच कर सकते है उंहें प्रोटियोलिसिस पर प्रभाव के लिए आकलन, दर PCSK9 परिपक्वता के कदम सीमित । इसके अतिरिक्त, इस विधि उच्च प्रवाह स्क्रीन के डिजाइन में उपयोगी हो जाएगा PCSK9 प्रोटियोलिसिस, जो अंततः एलडीएल-R करने के लिए PCSK9 की प्रस्तुति को बाधित करने के लिए अनुमानित है के मॉडुलन की पहचान (और PCSK9’s hypercholesterolemic प्रभाव मॉडुलन) . अंत में, इस प्रोटोकॉल आंतरिक रूप से कम गतिविधि के साथ अंय चिढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, बशर्ते कि मैं) एक विशिष्ट सब्सट्रेट-छेड़ो जोड़ी पाया जा सकता है, और द्वितीय) एक उपयुक्त intracellular लंगर सब्सट्रेट के लिए स्थापित किया जा सकता है ।
प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के ऊपर वर्णित एक विधि के लिए एकल कारोबार छेड़ने PCSK9 की आंतरिक रूप से कम गतिविधि पर काबू पाने और एक मजबूत तरीके से अपने proteolytic समारोह का मूल्यांकन वर्तमान । परख के प्रमुख अवधारणा एक …
The authors have nothing to disclose.
लेखक NHLBI/NIH (K08 HL124068 और एलआरपी HMOT1243), NCATS NIH नैदानिक और शोधों विज्ञान संस्थान उत्प्रेरक कार्यक्रम (UCSF UL1), TR000004 शैक्षणिक सीनेट, UCSF फाउंडेशन, के माध्यम से के माध्यम से उदार वित्त पोषण सहायता का धंयवाद एक गिलाद विज्ञान अनुसंधान विद्वान पुरस्कार, एक फाइजर आकांक्षा हृदय पुरस्कार (जॉन एस Chorba के लिए सभी) और हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान (अदरी एम. Galvan और Kevan एम. शोकत) ।
PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
(+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |