En hög genomströmning luciferas analysen att utvärdera proteolys av enda-omsättning proteas PCSK9
Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att utvärdera den proteolytiska aktiviteten av en inneboende lågaktivt, enda omsättning proteashämmare i cellulära sammanhang. Specifikt, används denna metod för att utvärdera den proteolytiska aktiviteten av PCSK9, en viktig drivkraft i lipidmetabolismen vars proteolytiska verksamhet krävs för dess ultimata hypercholesterolemic funktion.
Abstract
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) är en singel-omsättning proteas som reglerar low-density lipoprotein (LDL) serumnivåer och därmed hjärt-kärlsjukdom. Även om PCSK9 proteolys krävs för dess full hypercholesterolemic effekt, utvärdering av dess proteolytiska funktion är utmanande: PCSK9 är endast känt att klyva sig genomgår bara en enda omsättning och efter proteolys, behåller dess substrat i dess aktiva platsen som en auto-hämmare. De metoder som presenteras här beskriva en analysmetod som övervinner dessa utmaningar. Analysen fokuserar på intermolekylära proteolys i en cell-baserade sammanhang och länkar framgångsrika klyvning till aktiviteten utsöndrade luciferas, som enkelt kan läsas i konditionerat medium. Via sekventiella steg mutagenes, övergående transfection och en luciferas avläsning, analysen kan probe PCSK9 proteolys under förhållanden av antingen genetisk eller molekylär störning på ett sätt som hög genomströmning. Detta system är väl lämpad för såväl biokemiska utvärdering av kliniskt identifierade missense singel-nukleotid polymorfismer (SNP), samt för när det gäller screening av småmolekylär hämmare av PCSK9 proteolys.
Introduction
PCSK9 riktar den LDL-receptorn (LDL-R) för nedbrytning, höja LDL-kolesterol (LDL-C) och körning aterosklerotisk hjärtsjukdom1,2. Therapeutics inriktning PCSK9 kraftfullt sänka LDL-C och förbättra kardiovaskulärt utfall för patienter, även när de läggs till en aggressiv lipidsänkande behandling med statiner3,4. För närvarande godkända behandlingar är begränsad till antikroppsbaserade metoder, dock och lider av bristande kostnadseffektivitet5,6. För att lösa problemet, behövs billigare behandlingsalternativ, ett sätt att identifiera patienter sannolikt att vinna större fördelar, eller båda.
Småmolekylär metoder kunde rikta intracellulära PCSK9, ger en förbättrad administreringsväg och minska kostnaderna, vilket gör dem till den ”heliga Graalen” i detta område7. Dock PCSK9 har visat sig svårt att drogen av små molekyler. Som ett proteas är inriktning PCSK9’s proteolytiska funktion en attraktiv strategi, som själv-proteolys är det hastighetsbegränsande steget i PCSK9 mognad8 som krävs för dess maximal effekt på LDL-R9. Hittills har dock denna strategi har inte varit framgångsrika, sannolikt på grund av PCSK9’s unika biokemi: PCSK9 klyver endast själv10, utför en enda-omsättning reaktion, och efter self-klyvning, PCSK9 prodomain förblir bundna i den aktiva platsen som en Auto-hämmare11, förhindra avläsningen av någon ytterligare proteas aktivitet.
Denna artikel presenterar en metod för att utvärdera PCSK9 proteolytiska funktionen i hög genomströmning mode8. Via webbplats riktad mutagenes, kan utredare använda denna analys för att undersöka effekterna av kodning SNPs hittades i kliniken för att bedöma dem för effekter på proteolys, det hastighetsbegränsande steget i PCSK9 mognad. Dessutom, kommer att denna metod vara användbart i utformningen av hög genomströmning skärmar att identifiera modulatorer av PCSK9 proteolys, som förväntas i slutändan störa presentationen av PCSK9 till LDL-R (och modulera PCSK9’s hypercholesterolemic effekt) . Avslutningsvis kan detta protokoll anpassas till andra proteaser med egensäkra låg aktivitet, förutsatt att i) ett visst substrat-proteas par kan hittas, och ii) en lämplig intracellulära ankare kan fastställas för substratet.
Protocol
Representative Results
Discussion
De experimentella procedurer som beskrivs ovan presenterar en metod för att övervinna den egensäkra låg aktiviteten av den enda-omsättning proteasen PCSK9 och utvärdera dess proteolytiska funktion i ett robust sätt. Nyckelbegreppet i analysen bygger på omvandla en singel-omsättning händelse till en enzymatiskt förstärkta avläsning. Styrkan i analysen är relativt kort tid och användarvänlighet av luciferas reportern, liksom dess skalbarhet till hög genomströmning strategier. Dessutom utvärderar analysen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar generöst finansiering stöd från NHLBI/NIH (K08 HL124068 och LRP HMOT1243), NCATS/NIH genom UCSF klinisk och translationell Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), UCSF akademiska senaten, Stiftelsen Hellman, en Gilead Sciences Research Scholar Award, en Pfizer ASPIRE hjärt-Award (alla John S. Chorba) och Howard Hughes Medical Institute (till Adri M. Galvan och Kevan M. Shokat).
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Authors | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Authors | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
References
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 – A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
