لوحة الفلورة تعدد الإرسال الآلي للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة الكبدية الفورمالين--ثابت
Summary
بروتوكول مفصل للوحة علامة ستة الفلورة متعدد هو الأمثل وتنفيذها، باستخدام الملطخ الآلي لنتائج أكثر اتساقا وأقصر وقت إجراء. هذا النهج يمكن تكييفها مباشرة بأي مختبر للدراسات المناعية-الأورام.
Abstract
استمرار التطورات في علم الأورام المناعية تتطلب زيادة فهم آليات المناعة السرطان. تحليل عينات الأنسجة من الخزعات (FFPE) الفورمالين–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين إيمونوبروفيلينج أصبح أداة أساسية لفهم تعقيدات علم المناعة الورم واكتشاف رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي. إيمونوبروفيلينج تحليل الأنسجة يتطلب تقييم علامات مجتمعة، بما في ذلك الفئات السكانية الفرعية الخلية الملتهبة ونقاط التفتيش، ومحصنة في ورم المكروية. ظهور أساليب الرواية المناعي متعدد يسمح لتحليل مولتيباراميتريك أكثر كفاءة لأقسام الأنسجة واحدة مما لا immunohistochemistry مونوبليكس القياسية (المدينة). واحد الفلورة متعدد المتاحة تجارياً (إذا) الأسلوب هو استناداً إلى تضخيم إشارة تيراميدي، وجنبا إلى جنب مع تحليل مجهرية متعددة الأطياف، يسمح لفصل إشارة أفضل لعلامات مختلفة في الأنسجة. هذه المنهجية متوافق مع استخدام unconjugated الأجسام الأولية التي قد تم تحسينها للمدينة الموحدة على عينات الأنسجة FFPE. هنا يصف لنا بالتفصيل بروتوكولا مؤتمتة تسمح متعدد إذا وضع العلامات لعينات الأنسجة الكبدية مع لوحة جسم متعدد علامة الستة تضم PD-L1، PD-1، CD68، CD8، وكي-67، وسيتوكيراتينس AE1/AE3 مع 4، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي كونتيرستين خلية نووية. هو الأمثل في بروتوكول الفريق متعدد في الآلي الملطخ المدينة وقت المصبوغة هو أقصر من البروتوكول اليدوي ويمكن مباشرة تطبيقها وتكييفها من قبل المحقق أي مختبر للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة FFPE البشرية. ووصف أيضا هي عدة عناصر وأدوات، بما في ذلك أسلوب إسقاط–عنصر تحكم لمراقبة الجودة الجميلة للوحة إذا كان متعدد جديدة، التي تعتبر مفيدة للتحسين والتحقق من صحة هذا الأسلوب.
Introduction
إيمونوبروفيلينج تحليل عينات الأنسجة FFPE الورم قد أصبح عنصرا أساسيا في الدراسات المناعية-الأورام، خاصة بالنسبة لاكتشاف والتحقق من صحة رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي في سياق التجارب السريرية1 ،2. يبقى المدينة اللونية، تشروموجينس الكيميائية مثل ديامينوبينزيديني، باستخدام تقنية قياسية في تشخيص الأمراض إيمونولابيلينج من الأنسجة خزعة3. المدينة الموحدة يمكن أن تستخدم أيضا لسرطان الأنسجة إيمونوبروفيلينج، بما في ذلك كوانتيتيشن من الفئات السكانية الفرعية من الخلايا المرتبطة بالأورام الليمفاوية، وتقييم مستويات التعبير من نقاط التفتيش المناعي مثل يجند موت الخلية المبرمج 1 (PD-L1)4 ،5. المدينة الموحدة محدودة، ومع ذلك، في أن يمكن أن يكون المسمى مستضد واحد فقط كل قسم الأنسجة. لأنه عادة ما تتطلب دراسات إيمونوبروفيلينج تحليل التعبير مجتمعة من عدة علامات، سيتطلب استخدام المدينة الموحدة تلطيخ لمقاطع متعددة من الأنسجة، وكل ملطخة بعلامة واحدة، و، ولذلك، سيكون محدودة إلى حد كبير لتحليل عينات الأنسجة الصغيرة مثل الأساسية إبرة الخزعات. طرق المدينة القياسية أيضا محدودة لتقييم العلامات التي يتم كويكسبريسيد عن الخلية متنوعة من السكان، كما شائع مع علامات الحاجز المناعي مثل PD-L1، التي يعبر عنها بالضامة المرتبطة بالورم والخلايا السرطانية. أبلغ هذا القيد في، على سبيل المثال، استخدام معيار مونوبليكس المدينة من أخصائيي علم الأمراض للتحليل الكمي لعلامة المدينة أعرب عنها الخلية مختلف أنواع6. تطوير تقنيات المدينة اللونية متعدد توظيف تشروموجينس الملونة المتنوعة على نفسه يمثل قسم الأنسجة النهوض على الأسلوب القياسي مونوبليكس المدينة،7 على الرغم من أنها تظل محدودة إيمونولابيلينج لعدد قليل علامات، ويقدم أيضا التحديات تقنية هامة للتقييم السليم لعلامات المعرب عنها في المقصورات سوبسيلولار نفس السكان الخلية نفسها.
المحاذير المذكورة أعلاه فيما يتعلق بتوافر الأنسجة من العينات السريرية، فضلا عن القيود المفروضة على تقنيات المدينة اللونية المتعددة، قد أدت إلى الحاجة إلى تطوير تحسين طرائق متعدد للدراسات المناعية-الأورام استناداً إلى وضع العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع التصوير النظم التي يمكن فعلياً فصل إشارات فلوروفوريس متعددة من نفس الشريحة. واحد مثل هذا الأسلوب يستند إلى تضخيم إشارة تيراميدي (TSA) جنبا إلى جنب مع تصوير مجهرية متعددة الأطياف للون كفاءة الفصل8. توظف مجموعة متاحة تجارياً على أساس حساب السياحة الفرعي فلوروفوريس الأمثل ل التصوير المتعدد الأطياف8 (انظر الجدول للمواد). ميزة هامة من هذا النظام هو توافقه مع نفس الأجسام المضادة الأولية غير مسمى التي تم التحقق من صحتها والأمثل لمعيار اللونية المدينة9،،من1011. وهذا ما يسمح أسرع الأمثل ليس فقط ولكن أيضا المرونة في التعديلات الأمثل ولوحة تتضمن أهدافا جديدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الأمثل طريقة حساب السياحة الفرعي الفلورة متعدد (mIF) المتاحة تجارياً الآلي المدينة الملطخ بالأنظمة، مما يسمح لنقل مباشر من مونوبليكس المدينة اللونية للقوة المتعددة الجنسيات.
نقدم هنا بروتوكولا لفريق القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات للدراسات المناعية-الأورام يستند الآلي صبغة mIF حساب السياحة الفرعي ويستخدم ماسح المتعدد الأطياف للتصوير. هذا البروتوكول يمكن تكييفها وتعديلها بواسطة أي مستخدم المختبر مع الوصول إلى وصف الأجهزة والمواد الكاشفة. يشمل البروتوكول فريق من ستة أجسام الأولية إيمونوبروفيلينج من الأورام السرطانية: PD-L1، PD-1، CD68 (كعلامة بلعم عموم)، CD8 (خلايا T-السامة للخلايا)، كي-67، و AE1/AE3 (pan-سيتوكيراتين، تستخدم كعلامة الظهارية للتعرف على سرطان خلايا). دراسة حديثة توضح الاستفادة المثلى من بروتوكول mIF إدارة أمن النقل اليدوي باستخدام المدينة اللونية كمرجع قياسي للتحقق من صحة متعدد تلطيخ12. قد وضعت طريقة تحديث المعروضة هنا باستخدام مجموعة حساب السياحة الفرعي المتاحة تجارياً، وسبعة ألوان محسنة في الملطخ الآلي، تقصير الوقت المصبوغة من 3 – 5 أيام إلى ح 14، بينما أيضا تحسين اتساق تلطيخ جذريا. بالإضافة إلى البروتوكول الرئيسية المفصلة المقدمة هنا، يتضمن قسم المواد التكميلية الأسلوب “إسقاط السيطرة”، عملية مراقبة نوعية إضافية لتقييم لوحة mIF جديدة، فضلا عن الملاحظات الفنية للتحسين، استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والتنمية من جديد الألواح المتعددة لمساعدة المستخدم على مختبر لإعداد وتحسين طريقة حساب السياحة الفرعي mIF mIF مخصصة لوحات.
Protocol
Representative Results
Discussion
ثورة العلاج المناعي السرطان الجارية هو فتح الرواية وواعدة الخيارات العلاجية ل مرضى السرطان13. التقدم المحرز في مجال علم الأورام المناعية سيتطلب زيادة المعرفة بالتهاب وورم المكروية، ليس فقط لفهم بيولوجيا الآليات المناعية التي تشارك في التسرطن ولكن أيضا للبحث عن المؤشرات الح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
قدم الدعم التحريري شومان ديبورا من ميديموني.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
