Geautomatiseerde Multiplex immunofluorescentie paneel voor Immuno-oncologie Studies over formaline-vaste Carcinoma weefsel Specimens
Summary
Een gedetailleerd protocol voor een zes-marker multiplex immunofluorescentie paneel is geoptimaliseerd en uitgevoerd, met behulp van een geautomatiseerde stainer voor meer consistente resultaten en een kortere tijd van de procedure. Deze aanpak kan direct worden aangepast door elk laboratorium voor immuno-oncologie studies.
Abstract
Verdere ontwikkelingen in immuno-oncologie vereisen een toegenomen inzicht in de mechanismen van kanker immunologie. De immunoprofiling analyse van weefselmonsters van Biopten van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) is een belangrijk instrument voor inzicht in de complexiteit van de Tumorimmunologie en ontdekken van nieuwe voorspellende biomarkers voor kanker immunotherapie geworden. Immunoprofiling analyse van weefsels vereist de evaluatie van gecombineerde markers, met inbegrip van inflammatoire cel subpopulaties en immuun controleposten, in de communicatie van de tumor. De komst van de nieuwe multiplex immunohistochemische methoden zorgt voor een efficiënter multiparametric analyse van enkele weefselsecties dan standaard monoplex immunohistochemistry (IHC). Een commercieel beschikbare multiplex immunofluorescentie zorgt (IF) methode is gebaseerd op tyramide-signaal versterking en, in combinatie met multispectrale microscopische analyse, voor een betere scheiding van het signaal van uiteenlopende markers in weefsel. Deze methodologie is compatibel met het gebruik van unconjugated primaire antilichamen die zijn geoptimaliseerd voor standaard IHC op FFPE weefselmonsters. Hierin beschrijven we in detail een geautomatiseerde protocol waarmee multiplex als etikettering van weefselmonsters carcinoom met een zes-marker multiplex antilichaam panel bestaande uit PD-L1, PD-1, CD68 CD8, Ki-67 en AE1/AE3 Cytokeratines met 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole Als een nucleaire cel counterstain. Het protocol multiplex deelvenster wordt in een geautomatiseerde IHC stainer geoptimaliseerd voor een kleuring tijd die korter is dan die van de handmatige protocol en kan worden direct toegepast en aangepast door elk laboratorium-Detective voor immuno-oncologie studies over menselijke FFPE weefselmonsters. Ook beschreven zijn verschillende controles en instrumenten, met inbegrip van een drop-control methode voor fijne controle van de kwaliteit van een nieuwe multiplex als panel, die nuttig voor de optimalisatie en validatie van de techniek zijn.
Introduction
Immunoprofiling analyse van FFPE tumor weefselsteekproeven uitgegroeid tot een essentieel onderdeel van immuno-oncologie studies, met name voor de detectie en validatie van nieuwe voorspellende biomarkers voor kanker immunotherapie in het kader van klinische proeven1 ,2. Chromogenic IHC, met behulp van chemische chromogens zoals diaminobenzidine, blijft de standaard techniek in diagnostische pathologie voor de immunolabeling van de biopsie weefsel3. Standaard IHC kan ook worden gebruikt voor kanker weefsel immunoprofiling, met inbegrip van de kwantificatie van de subpopulaties van tumor-geassocieerde lymfocyten en de beoordeling van de niveaus van de expressie van immuun checkpoints zoals geprogrammeerde cel dood ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standaard IHC is echter beperkt, in die slechts één antigeen kan worden gelabeld per weefselsectie. Omdat immunoprofiling studies vergen doorgaans de analyse van de gecombineerde uitdrukking van verschillende markeringen, het gebruik van standaard IHC zou vereisen de kleuring van meerdere weefselsecties, elk gekleurd met een enkele gegevensmarkering, en daarom zou aanzienlijk beperkt voor de analyse van kleine weefselsteekproeven zoals kern naald biopsieën. IHC standaardmethoden zijn ook beperkt zijn voor de beoordeling van de markeringen die zijn coexpressed door diverse cel populaties, zoals gebruikelijk is bij immuun checkpoint markeringen zoals PD-L1, die wordt uitgedrukt door zowel de kankercellen als de tumor-geassocieerde macrofagen. Deze beperking is gemeld in, bijvoorbeeld, het gebruik van standaard monoplex IHC door pathologen voor de kwantitatieve analyse van een marker van de IHC uitgedrukt door diverse cel typen6. De ontwikkeling van een multiplex chromogenic IHC technieken met divers gekleurde chromogens op de dezelfde weefsel sectie vertegenwoordigt een vooruitgang over de IHC monoplex standaardmethode,7 hoewel ze blijven beperkt door de immunolabeling van slechts een paar Markeringen en ook een belangrijke technische uitdaging voor de juiste beoordeling van markeringen uitgedrukt in de dezelfde subcellular compartimenten van de dezelfde cel populaties aanwezig.
De voornoemde beperkingen met betrekking tot de beschikbaarheid van het weefsel van klinische monsters, evenals de beperkingen van multiplex chromogenic IHC technieken, hebben aanleiding gegeven tot de noodzaak tot het ontwikkelen van verbeterde multiplex methoden voor immuno-oncologie studies op basis van fluorescerende labeling gecombineerd met beeldvormende systemen die effectief de signalen van meerdere fluorophores van de dezelfde dia scheiden kunnen. Een dergelijke techniek is gebaseerd op tyramide signaal versterking (TSA) in combinatie met multispectrale microscopie imaging voor efficiënte kleur scheiding8. Een commercieel beschikbare TSA gebaseerde kit maakt gebruik van fluorophores geoptimaliseerd voor multispectrale imaging8 (Zie Tabel van materialen). Een cruciaal voordeel van dit systeem is de verenigbaarheid ervan met de dezelfde labelloze primaire antilichamen die reeds zijn gevalideerd en geoptimaliseerd voor standaard chromogenic IHC9,10,11. Hierdoor niet alleen sneller optimalisatie, maar ook flexibiliteit in de optimalisatie en paneel wijzigingen opnemen van nieuwe doelen. Bovendien, de methode van de TSA multiplex immunofluorescentie (mIF) kan worden geoptimaliseerd voor commercieel beschikbare geautomatiseerde IHC stainer systemen, waardoor voor een eenvoudige overdracht van monoplex chromogenic IHC aan mIF.
Hier presenteren we een protocol voor een mIF paneel voor immuno-oncologie-studies die is gebaseerd op mIF TSA kleuring geautomatiseerde en een multispectrale scanner voor imaging gebruikt. Dit protocol kan worden aangepast of gewijzigd door elk laboratorium gebruiker met toegang tot de beschreven instrumentatie en reagentia. Het protocol bevat een panel van zes primaire antilichamen voor de immunoprofiling van carcinomen: PD-L1, PD-1, CD68 (als een pan-macrofaag marker), CD8 (cytotoxische T cellen), Ki-67, en AE1/AE3 (pan-cytokeratin, gebruikt als een epitheliale merker voor de identificatie van carcinoom cellen). Een recente studie beschrijft de optimalisatie van een handmatige TSA mIF protocol met behulp van chromogenic IHC als standaard referentie voor het valideren van de multiplex12kleuring. De bijgewerkte methode hier gepresenteerd is ontwikkeld met behulp van een commercieel beschikbaar, zeven-kleur TSA kit geoptimaliseerd in een geautomatiseerd brandschilderen, drastisch verkorten van de kleuring tijd van 3 – 5 dagen tot 14 h, terwijl ook het verbeteren van de consistentie van de kleuring. Naast het gedetailleerde belangrijkste protocol hier gepresenteerd, bevat een sectie Aanvullende materialen de “drop-control”-methode, een extra kwaliteitscontrole proces te evalueren van een nieuw mIF deelvenster, evenals technische notities voor de optimalisatie, probleemoplossing en ontwikkeling van nieuwe multiplex panelen om de laboratorium-gebruiker instellen en optimaliseren van de mIF TSA methode voor aangepaste mIF panelen te helpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De lopende kanker immunotherapie revolutie is opening nieuwe en veelbelovende therapeutische opties voor kanker patiënten13. Vooruitgang op het gebied van immuno-oncologie vergt meer kennis van de inflammatoire tumor communicatie, niet alleen om te begrijpen van de biologie van de immunologische mechanismen die betrokken zijn bij carcinogenese, maar ook om voorspellende biomarkers voor nieuwe immunotherapie gebaseerde behandelingen1,2. Al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Redactionele ondersteuning werd geleverd door Deborah Shuman van MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
