Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma
Summary
Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.
Abstract
Continua evolución de inmuno-Oncología requiere una mayor comprensión de los mecanismos de la inmunología del cáncer. El análisis immunoprofiling de muestras de tejido de biopsias de formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) se ha convertido en una herramienta clave para entender la complejidad de la inmunología tumoral y descubrimiento de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer. Immunoprofiling análisis de los tejidos requiere la evaluación de marcadores combinados, incluyendo las subpoblaciones de células inflamatorias y los puestos de control inmunes en el microambiente del tumor. El advenimiento de métodos inmunohistoquímicos multiplex novela permite un más eficiente Análisis multiparamétrico de secciones del tejido fino solo que hace estándar monoplex immunohistochemistry (IHC). Una inmunofluorescencia múltiplex disponible comercialmente (si) método se basa en la amplificación de la señal tyramide y, combinado con el análisis microscópico multiespectral, permite una mejor separación de señal de diversos marcadores en el tejido. Esta metodología es compatible con el uso de anticuerpos primarios no conjugados que se han optimizado para IHC estándar en las muestras de tejido FFPE. Adjunto describimos detalladamente un protocolo automatizado que permite multiplex si el etiquetado de las muestras de tejido de carcinoma con un panel de anticuerpos multiplex marcador seis compuesto por PD-L1, 1 PD, CD68, CD8, Ki-67 y citoqueratinas AE1/AE3 con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole como una contratinción nuclear de la célula. El protocolo multiplex panel está optimizado en un teñidor automático de IHC para un tiempo de tinción es más corto que el del protocolo manual y directamente aplicado y adaptado por cualquier investigador de laboratorio para estudios de inmuno-Oncología en muestras humanas de tejido FFPE. También se describe son varios controles y herramientas, incluyendo un método de control de gota fina control de calidad de un nuevo panel multiplex de IF, que son útiles para la optimización y validación de la técnica.
Introduction
Immunoprofiling análisis de muestras de tejido FFPE tumor se ha convertido en un componente esencial de los estudios de inmuno-Oncología, particularmente para el descubrimiento y validación de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer en el contexto de ensayos clínicos1 ,2. IHC cromogénica, utilizando químicos cromógenos como diaminobenzidina, sigue siendo la técnica estándar en patología diagnóstica de la inmunomarcación de biopsia del tejido3. IHC estándar puede usarse también para immunoprofiling de tejido de cáncer, incluyendo la cuantificación de subpoblaciones de linfocitos tumorales asociadas y la evaluación de los niveles de expresión de checkpoints inmunes como ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1)4 ,5. IHC estándar es limitada, sin embargo, en sólo un antígeno puede ser etiquetado según la sección de tejido. Porque immunoprofiling estudios requieren típicamente el análisis de la expresión combinada de varios marcadores, el uso de IHC estándar requiere la tinción de múltiples secciones de tejido, cada uno manchado con un marcador único y por lo tanto, sería sustancialmente limitado para el análisis de muestras de tejido pequeñas tales como las biopsias de aguja de núcleo. Estándar métodos IHC también son limitados para la evaluación de marcadores que son coexpressed por poblaciones de diversas células, como sucede con los marcadores de control inmune como PD-L1, que es expresada por macrófagos asociados a tumor y las células cancerosas. Esta limitación se ha divulgado en, por ejemplo, el uso del estándar monoplex IHC por los patólogos para el análisis cuantitativo de un marcador IHC expresado por células diversos tipos6. El desarrollo de técnicas de IHQ cromogénicos múltiplexes empleando diversos cromógenos coloreados en el mismo tejido sección representa un adelanto sobre el método estándar de monoplex IHC,7 aunque siguen siendo limitados por la inmunomarcación de unos pocos marcadores y también presenta un importante desafío técnico para la adecuada evaluación de marcadores expresados en el mismo compartimientos subcelulares de las mismas poblaciones de células.
Las salvedades mencionadas en cuanto a la disponibilidad de tejido de las muestras clínicas, así como las limitaciones de las técnicas de IHQ cromogénicos multiplexores, han dado lugar a la necesidad de desarrollar mejores métodos multiplexores para estudios de inmuno-Oncología etiquetado fluorescente combinado con sistemas que efectivamente pueden separar las señales de múltiples fluoróforos de la misma diapositiva de imágenes. Una tal técnica se basa en la amplificación de la señal de la tyramide (TSA) combinada con la proyección de imagen multiespectral de la microscopia de color eficiente separación8. Un kit disponible comercialmente basados en TSA emplea fluoróforos optimizado para imágenes multiespectrales8 (véase Tabla de materiales). Una ventaja fundamental de este sistema es su compatibilidad con los mismos anticuerpos primarios sin etiqueta que ya validadas y optimizadas para el estándar cromogénico IHC9,10,11. Esto permite no sólo la optimización más rápida sino también la flexibilidad en las optimización y el panel de modificaciones incorporando nuevos objetivos. Además, el método TSA multiplex inmunofluorescencia (mIF) puede ser optimizado para comercios IHC stainer sistemas automatizados, lo que permite una transferencia sencilla de monoplex IHC cromogénico a FOMIN.
Aquí presentamos un protocolo para un panel de FOMIN para estudios de inmuno-Oncología basada en automatizado FOMIN TSA tinción y utiliza un escáner multiespectral para la proyección de imagen. Este protocolo puede ser adaptado y modificado por cualquier usuario con acceso a la instrumentación descrita y reactivos de laboratorio. El protocolo incluye un panel de seis anticuerpos primarios para la immunoprofiling de los carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como un marcador de pan-macrófago), CD8 (células T-citotóxicas), Ki-67 y AE1/AE3 (cacerola-cytokeratin, utilizado como marcador epitelial para la identificación de células del carcinoma). Un estudio reciente describe la optimización de un protocolo de FOMIN TSA manual utilizando IHC cromogénico como referencia estándar para validar el múltiplex tinción12. El método actualizado presentado aquí ha sido desarrollado por con el equipo de TSA comercialmente disponible, siete colores optimizado en un teñidor automático, drásticamente acortando el tiempo de tinción de 3 – 5 días a 14 h, mejorando también la consistencia de la tinción. Además del protocolo principal detallado presentado aquí, una sección de Materiales complementarios incluye el método de “control de la gota”, un proceso de control de calidad adicional para evaluar un nuevo panel de FOMIN, así como notas técnicas para la optimización, solución de problemas y desarrollo de nuevos paneles múltiplexes para ayudar al usuario del laboratorio para configurar y optimizar el método TSA de mIF FOMIN personalizados paneles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La revolución de la inmunoterapia de cáncer curso es apertura nuevas y prometedoras opciones terapéuticas para pacientes de cáncer13. Avances en el campo de la inmuno-Oncología requiere mayor conocimiento del microambiente del tumor inflamatorio, no sólo para entender la biología de los mecanismos inmunológicos involucrados en la carcinogénesis pero también para encontrar biomarcadores predictivos para el nuevo tratamientos basados en inmunoterapia1,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyo editorial fue proporcionada por Deborah Shuman de MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
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